والطريقة وكالة حماية البيئة معدلة 1623 يستخدم تماسي تدفق الجوف الألياف الترشيح الفائق والحرارة خطوات تمييز لكشف تنتقل عن طريق الماء<em> الكريبتوسبوريديوم</em> و<em> الجيارديات النيابة.</em
Summary
هذا البروتوكول ويصف استخدام عرضية نظام تدفق الترشيح الفائق جوفاء من الألياف تركيز العينة وانصرافا الحرارة كما خطوات بديلة للكشف عن طريق المياه<em> الكريبتوسبوريديوم</em> و<em> الجيارديات</em> الأنواع باستخدام أسلوب وكالة حماية البيئة 1623.
Abstract
الكريبتوسبوريديوم والجيارديات الأنواع انتشارا هما من أكثر الأوليات التي تسبب تفشي مرض الاسهال التي تنقلها المياه في جميع أنحاء العالم. لتوصيف أفضل من انتشار هذه الجراثيم، وقد وضعت وكالة حماية البيئة 1623، والطريقة المستخدمة لرصد مستويات من هذه الكائنات الحية في المياه الصالحة للشرب الولايات المتحدة توفر 12. الأسلوب لديه ثلاثة أجزاء رئيسية، الأول هو تركيز في عينة التي يتم تصفية لا يقل عن 10 لتر من المياه السطحية الخام. ومزال ثم الكائنات الحية والانقاض المحاصرين من تصفية وطرد لتركيز مزيد من العينة. في الجزء الثاني من يستخدم أسلوب إجراء فصل immunomagnetic حيث يتم تطبيق عينة المياه مركزة على حبات immunomagnetic التي تربط خصيصا لبيض التوكسوبلازما الكريبتوسبوريديوم والجيارديات الخراجات السماح لإزالة المحددة للطفيليات من تحت الانقاض المركزة. يتم فصل هذه الأكياس ثم (س س) من حبات مغناطيسية من قبل اإلجراءات تفكك حمضdure. في الجزء الأخير من الأسلوب هو تلطيخ المناعي والتعداد حيث يتم تطبيق (س س) الخراجات إلى الملون، والشرائح، وعددت بواسطة المجهر.
طريقة 1623 أربعة تركيز عينة المدرجة نظم لالتقاط بيض التوكسوبلازما الكريبتوسبوريديوم والجيارديات الخراجات في الماء: مرشحات Envirochek (بال مال الشركة، آن آربر، MI)، Envirochek مرشحات ذات الجهد العالي (بال كوربوريشن)، والمرشحات Filta ماكس ((آيدكس)، ويستبروك، MA)، أو الطرد المركزي تدفق مستمر (Haemonetics، برينتري، MA). ومع ذلك، فقد تفاوتت الكريبتوسبوريديوم والمبالغ المستردة الجيارديات كيس (س س) إلى حد كبير اعتمادا على مصدر المياه ومصفوفة المرشحات المستخدمة 1،14. وقد تم مؤخرا جديد عرضية تدفق جوفاء من الألياف الترشيح الفائق (HFUF) نظام معروضة لتكون أكثر فاعلية وأكثر قوة في استعادة بيض التوكسوبلازما الكريبتوسبوريديوم والخراجات الجيارديات من المصفوفات المياه المختلفة، وعلاوة على ذلك، هو أقل تكلفة من خيار كبسولة أخرى فلترق ويمكن أن تركز مسببات الأمراض متعددة في وقت واحد 1-3،5-8،10،11. وبالإضافة إلى ذلك، الدراسات السابقة التي كتبها هيل وزملاء أثبتت أن HFUF تحسنت بشكل ملحوظ الكريبتوسبوريديوم بيض التوكسوبلازما المستردة عند مقارنة مباشرة مع المرشحات HV Envirochek 4. كما تم إدخال تعديلات إضافية على الطرق الحالية عن طريقة لتحسين الأداء. استبدال الإجراء تفكك حمض مع تفكك الحرارة وقد تبين أن تكون أكثر فعالية في فصل الكريبتوسبوريديوم من حبات مغناطيسية في بعض المصفوفات 9،13.
هذا البروتوكول وصفا لطريقة تعديل 1623 الذي يستخدم في الترشيح HFUF النظام الجديد مع خطوة التفكك الحراري. استخدام HFUF مع هذا الأسلوب تعديل هو بديل أقل تكلفة لالحالية خيارات أسلوب الترشيح وكالة حماية البيئة 1623، ويوفر المزيد من المرونة من خلال السماح للتركيز من الكائنات الحية متعددة.
Protocol
1. عرضية إجراء تدفق الترشيح الفائق الجوف من الألياف إعداد مخازن والحلول: الحل شطف (1 L): إلى 1 لتر من الماء درجة كاشف إضافة 0.1 عديد الفسفات الصوديوم غرام، 0.1 مل توين-80 و 0.01 مل Y-30 مضاد الرغوة. إعداد مرشح التجمع (الشكل 1) في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية: إدراج Masterflex I / P أنابيب المختبر خلال 73 I / P Masterflex رئيس مضخة سهل الحمل وصله بجهاز I / P Masterflex محرك فرش الدقة. تأمين أنابيب إلى 0-60 رطل، مقياس الضغط الجليسرين مليئة مزودة فرع معاهدة حظر الانتشار النووي T-الموصل المنبع من رأس المضخة مع المشبك المسمار، وإلى المصب T-الموصل HDPE من رأس المضخة. تجميع زجاجة retentate بملائمة 1 Nalgene 53-B ملء / التنفيس قبعة مع L / S Masterflex أنابيب مختبر 15 وT-الموصل وتأمين فإنه إلى 1 لتر Nalgene الثقيلة زجاجة البولي بروبلين. تناسب Masterflex L / S 24 ث الأنابيبإيث المشبك قرصة (الشبك قرصة 2) وتوصيله من الزجاجة retentate إلى الكثافة T-الموصل. Rexeed ربط L / S Masterflex أنابيب مختبر 24 من مقياس الضغط إلى قصي اساهي 25S عالية التدفق مديال مع المشبك المسمار، ومن مديال إلى زجاجة retentate. استخدم حسب الطلب محولات DIN مصممة لاستيعاب ربع أنابيب معرف "لتوصيل الأنابيب لمرشحة مستدقة جوفاء من الألياف. تناسب Masterflex L / S أنابيب مختبر 24 مع المشبك قرصة (الشبك قرصة 1) وذلك لربط ماصة بلاستيكية سعة 10 مل مع المكونات طرف والقطن إزالة لتكون بمثابة عينة خط امتصاص ونعلق ثم أنابيب إلى الكثافة T- الموصل. تناسب واحدة من نهاية الأنابيب Masterflex مختبر L/S-36 مع منحدر الشبك وربط أنابيب إلى ميناء النفايات السائلة التي تقع بالقرب من نهاية الخروج من مرشح. وضع الطرف الآخر في حاوية للنفايات. إضافة 0.01٪ (W / V) عديد الفسفات الصوديوم إلى عينة المياه L (10) والمزيج لمدة 3 دقائق. إغلاق المشبك قرصة 2وإزالة سقف تنفيس من الزجاجة retentate. ينبغي لجميع المشابك الأخرى مفتوحة. تحديد اتجاه مضخة لنقل السوائل من موصل-T لقياس الضغط (من اليمين إلى اليسار الشكل التالي 1). ضبط سرعة المضخة إلى 25٪ من السرعة القصوى وتشغيل المضخة. عندما زجاجة retentate هو 2/3 كامل، المشبك رشة مفتوحة (2) وتحل محل بسرعة سقف تنفيس للزجاجة retentate. تحقق من كل من خطوط والتجهيزات لضمان عدم وجود تسرب. زيادة ببطء سرعة المضخة إلى معدل الترشيح المطلوب (ما يقرب من 1.5 لتر / دقيقة)، والتحقق من وجود تسرب. باستخدام اسطوانة تخرج والموقت أو تدفق متر، والتحقق من معدل الراشح من المياه تخرج من خط مياه الصرف (الأزرق L / S 36 الأنابيب في الشكل 1). ويمكن تشكيل فقاعات الهواء عادة في نهاية الخروج من مرشح مما يجعل من الصعب التوصل إلى ضغط مستقرة ومعدل الترشيح. يتم تصحيح هذا عن طريق اختلاس خط مياه الصرف بواسطة اليد للحظة واحدة. هذا الإجراءوسوف اقناع عموما فقاعة الهواء إلى ميناء الترشيح والخروج عن طريق خط مياه الصرف. كرر حسب الحاجة، مع الأخذ في الاعتبار أن حجم حبة البازلاء فقاعات الهواء في كثير من الأحيان لا مفر منه. مراقبة عملية الترشيح. قياس وتسجيل الضغط ومعدل الترشيح حسب الحاجة. ينبغي الضغط أبدا يتجاوز 20 رطل. فمن المستحسن أن معدل الترشيح يجب ألا يتجاوز 2.0 لتر / دقيقة. من المهم أن يتم رصد حجم الماء في زجاجة retentate للتأكد من أنه لم يصب. فمن الطبيعي لحجم لزيادة أو خفض قليلا. وإذا كان حجم الماء في الزجاجة retentate اقل من 1/3 كامل، ثم إزالة سقف تنفيس ورشة قريبة المشبك 2 على خط زجاجة retentate. جعل حجم العودة الى كامل 2/3 حول فتح المشبك واستبدالها بسرعة سقف تنفيس، وضمان ختم مشددة. إذا كانت وحدة التخزين في زجاجة retentate يسقط بسرعة وبشكل مستمر، ثم تأكد من غطاء زجاجة retentate ضيقة وغطاء تنفيس هو في مكان آمن، وأن TUBIنانوغرام لا يزال على اتصال مع عينة المياه. إذا كانت هذه القضايا لا تحدث، فمن المرجح أن الختم في غطاء زجاجة retentate هو سيء ويجب استبداله. عندما الحاوية عينة فارغة، على مقربة مباشرة المشبك رشة 1، والحد من سرعة المضخة إلى 20٪ من الحد الأقصى، وإزالة الغطاء تنفيس من الزجاجة retentate وإغلاق المشبك المنحدر. ضبط حجم العينة في زجاجة retentate إلى ما يقرب من 200 مل من خلال تشديد أو تخفيف المشبك المنحدر. بعد ما يقرب من حجم 200 مل، وتشديد الرقابة على المشبك منحدر للخطوات شطف (1،11-1،12). إضافة 500 مل من محلول شطف للحاوية العينة وشطف داخل الحاوية. وضع ماصة 10 مل متصلا عينة خط امتصاص في وعاء يحتوي على محلول شطف. تأكد من أن يتم إغلاق المشبك المنحدر. قرصة مفتوحة المشبك (1) ورشة قريبة المشبك 2 حظات لوضع حل شطف. بعد يتم رسمها 500 مل من محلول شطف يصل، قرصة وثيق المشبك (1) ورشة مفتوحة المشبك 2. السماح للحل شطف أن تعمم لمدة 5 دقائق مع سرعة المضخة من 20٪ من الحد الأقصى. ضبط حجم العينة في زجاجة retentate إلى حوالي 100 مل من خلال تشديد أو تخفيف المشبك منحدر على خط مياه الصرف. تشديد حملتها ضد منحدر، والسماح للعينة أن تعمم لمدة 1 دقيقة. تجنب سحب الهواء في أنابيب من خلال ضمان أن حجم العينة في زجاجة retentate مرتفع بما يكفي لتغطية L / S 15 أنابيب دخول زجاجة retentate. عكس اتجاه المضخة الأمر الذي يفرض على عينة في زجاجة retentate. السماح لتشغيل المضخة في الاتجاه المعاكس لمدة 20 ثانية مما أدى إلى ما مجموعه 225 مل ~ في زجاجة retentate. إيقاف تشغيل المضخة. إزالة I / P Masterflex 73 أنابيب من رأس المضخة وقطع مقياس الضغط. قطع L / S Masterflex 24 أنابيب الخروج من مرشحة مستدقة جوفاء من الألياف. عقد الأنبوب فوق زجاجة retentate لفرض أية عينات متبقية فيretentate زجاجة. قطع كل أنبوب من الزجاجة، ويستعاض عن غطاء التنفيس مع غطاء غير التنفيس. الاستمرار في إجراء IMS / ايفا مع retentate ~ مل 225. 2. Immunomagnetic الفاصل الداخلي إعداد مخازن والحلول: السماح للمخازن المدرجة في Dynabeads: الكريبتوسبوريديوم / الجيارديات عدة التحرير والسرد لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. 1X SL-عازلة ج: إضافة 1 مل من 10X SL-عازلة لمل من الماء الصف 9 كاشف. نقل ~ 225 مل من السائل من زجاجة retentate إلى المسمى أنبوب 250 مل الطرد المركزي مخروطي. شطف الزجاجة retentate مرتين مع 10 مل من الماء الكاشف، وإضافة إلى يشطف أنبوب الطرد المركزي مخروطي. منبذة تعليق في 1500 XG لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية مع عدم وجود فرامل. نضح بعناية وطاف من واجهة الهواء والماء إلى 5 مل فوق بيليه معبأة عن كل مل 0.5 من حجم بيليه (أي نضح إلى 15 مل فوق حجم بيليه من 1.3 مل، ونضح إلى 5 مل لبيليه من 0.5 مل أو أقل). resuspend بدقة بيليه في طاف و / أو ماصة vortexing الاختلاط. نقل كل حجم 5 مل من السائل في أنبوب شقة من جانب وL10 Dynal 1 مل يحتوي على كل من 10X SL-العازلة ألف و10X SL-العازلة باء شطف أنبوب الطرد المركزي مخروطي مرتين مع 2.5 مل من الماء كاشف وإضافة إلى شطف الأنبوب L10، ليصل إجمالي حجم في مل L10 أنبوب إلى 12، بما في ذلك المخازن. أضف 100 ميكروليتر كل من Dynabeads معلق الجيدة الخلط مكافحة الكريبتوسبوريديوم ومكافحة الجيارديات إلى الأنبوب L10. تدوير أنبوب L10 في 18 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على خلاط محور دوار. وضع الجانب المسطح من الأنبوب L10 ضد المغناطيس MPC-6 والصخور اليد بلطف أنبوب نهاية إلى نهاية، 180 درجة لمدة 2 دقيقة. الحفاظ على أنبوب L10 في المغناطيس MPC-6 مع الجانب المغناطيس تصل، صب طاف بعيدا عن حبة / (س س) كيس المجمعات بوالثانية إلى المغناطيس. إزالة أنبوب L10 من المغناطيس وإضافة 0.5 مل من 1X SL-A عازلة للأنبوب. نقل تعليق باستخدام اثنين يشطف إضافية من 0.5 مل من 1X SL-A العازلة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل الذي عقد في لجنة السياسة النقدية-S مع المغناطيس في الوضع العمودي. صخرة بلطف الأنبوب في درجة MPC-S 180 مغناطيس لمدة 1 دقيقة. مع المغناطيس في مكان، ونضح وطاف باستخدام ماصة باستير توجه إلى الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى الجانب الأمامي من أنبوب microcentrifuge، إزالة المغناطيس ويهز أنبوب بلطف فقط حتى يتم معلق الخرز. استبدال المغناطيس في الوضع الرأسي ويهز بلطف الأنبوب 180 درجة لمدة 1 دقيقة. نضح في برنامج تلفزيوني شطف، من دون إزعاج بيليه حبة، وذلك باستخدام ماصة باستير لإزالة الحطام وأكبر قدر ممكن. إزالة المغناطيس وإضافة 50 ميكرولتر من المياه الكاشف إلى الجانب الخلفي من أنبوب microcentrifuge. دوامة أنبوب بأقصى سرعة لمدة 50 ثانية،احتضان ثم الأنبوب في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها دوامة من الثانية 30. استبدال المغناطيس في لجنة السياسة النقدية-S في وضع مائل، التي تربط بين حبات إلى المغناطيس وترك الأكياس (س س) في السائل. تطبيق نظام التعليق كيس (س س) إلى شريحة SingleSpot جيدا. كرر الخطوة 2،10، وتطبيق السائل إلى البئر نفسه الذي يحتوي على التفكك الأول. الشريحة مكان على 37 درجة مئوية الشريحة الأكثر دفئا لمدة 1 ساعة حتى يجف تعليق على الشريحة بشكل جيد. 3. تلطيخ والامتحانات إعداد مخازن والحلول: العمل دابي الحل: إضافة 25 ميكرولتر من محلول المخزون دابي (2 ملغ / مل في الميثانول) إلى 25 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الأوراق المالية والحلول محل العمل بين 1 درجة مئوية و 10 درجة مئوية في الظلام. تطبيق 50 ميكروليتر من الميثانول إلى الشريحة بشكل جيد واتركه حتى يجف في درجة حرارة الغرفة. إضافة 50 ميكرولتر من حل دابي تعمل على الشريحة بشكل جيد واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدام Kimwiالمؤسسة العامة للذبالة للدابي من البئر. تطبيق 50 ميكرولتر من EasyStain. احتضان في 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ذبالة وصمة عار قبالة بشكل جيد مع Kimwipe، ثم قم بإضافة 300 ميكروليتر ببطء من البرد العازلة EasyStain التلاعب، والسماح لها بالتدفق على الحافة تماما. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدام Kimwipe إلى ذبالة المنطقة العازلة من البئر، وتطبيق 10 ميكرولتر من متوسط EasyStain المتزايدة. تطبق بعناية زلة غطاء، وإزالة أي فقاعات التي تحدث. اغلاق الغطاء زلة مع طلاء الأظافر واضح. مسح الشريحة بأكملها باستخدام فلتر FITC، في التكبير 200X مجموع، لكائنات التفاح الأخضر بيضوي الشكل أو كروية الفلورسنت التي تشبه البيضة المتكيسة 1 أو كيس. فحص جميع هذه الأجسام مع مرشح دابي على التكبير مجموع 1000X ثم مع مدينة دبي للإنترنت، أيضا على التكبير مجموع 1000X. تسجيل حجم باستخدام ميكرومتر بصري معايرة والصفات المورفولوجية. وثيقة النتائج. ملاحظة: تقنية المعلومات الإضافيةويمكن الاطلاع على املعلومات حول الإجراء الأصلي في نسخة ديسمبر 2005 من وكالة حماية البيئة أسلوب 1623 12. يستخدم عرضية إجراء تدفق الترشيح الفائق جوفاء من الألياف وصفها في مكان من القسم 12.0 من أسلوب وكالة حماية البيئة 1623. التفكك الحراري يعدل القسم 13.3.3 من أسلوب وكالة حماية البيئة 1623. الإجراء يصف أيضا برنامج تلفزيوني إضافية شطف أثناء عملية IMS التي يمكن إدراجها في النسخة ديسمبر 2005 الطريقة 1623 بعد قسم 13.3.2.16. يتم سرد قائمة كاملة من الكواشف والمواد الاستهلاكية والمعدات المستخدمة في أسلوب وكالة حماية البيئة 1623 بما في ذلك هذه التعديلات في لائحة المعدات. 4. ممثل النتائج تم الكشف عن بيض التوكسوبلازما الكريبتوسبوريديوم والجيارديات الخراجات تعافى من خلال عمليات الترشيح وفصل immunomagnetic بواسطة التحليل المهجري. في التكبير 200X مجموع، كل كائن حي واظهار نمط تلطيخ نموذجي، والحجم، والشكل كما هو مبين في الشكل 2 </stronوينبغي ز> وحظ كذلك باستخدام الغمر النفط في التكبير مجموع 1000X. وهذا سوف يسمح لقياس وتحديد ملامح نموذجي إما تحديد ملامح أو شاذة من شأنها أن تستبعد تحديد إيجابي. الكريبتوسبوريديوم هو بيضوي الشكل إلى كائن كروي 4-6 ميكرون في القطر الذي يسلك الرائعة مضان FITC التفاح الأخضر مع حواف الضوء الزاهية (الشكل 3A ). مع الأشعة فوق البنفسجية دابي، سيقوم البيوض المتكيسة يحمل واحدة من الفئات ميزة نموذجية التالية: ضوء تلطيخ الداخلية زرقاء مع حافة خضراء وليس نواة مميزة (دابي السلبية)، مكثفة تلطيخ الداخلية الزرقاء، أو ما يصل إلى أربعة متميزة، سماء زرقاء نوى (دابي الإيجابية – الشكل 3B). ملامح غير نمطية تشمل الانحرافات في بنية اللون، أو دابي مضان (على سبيل المثال، نواة ملطخة كثيرة جدا، وأحمر الاستشعاع الهياكل الداخلية). إذا كان الكائن فلوري واجتمع معايير لFITC نموذجي وتلطيخ دابي، يتم فحص باستخدام الفرق يخدع تدخلtrast (DIC). يتم فحص الكائن على الخصائص المورفولوجية غير نمطية خارجية أو داخلية مثل زخرفة جدار الخلية، أو واحد أو اثنين نوى كبير ملء الخلية. إذا لم يتم الالتزام هياكل نمطية، يتم تسجيل الكائن في عدد ايفا الكلي وتصنيفها على أنها بنية غير متبلور فارغة أو مع 1-4 sporozoites الحالي (الشكل 3C). وبالمثل، يتم فحص الجيارديات الاجسام الشبيهة فيما يتعلق تلطيخ FITC ودابي وكذلك الخصائص مدينة دبي للإنترنت، مثل axonemes، وهيئات وسيطة، ونوى الجيارديات الخراجات هي جولة إلى بيضوي الشكل الأشياء الرائعة التفاح الأخضر، 8 – 18 ميكرومتر طويلة من قبل 5 – 15 ميكرومتر واسعة مع حواف الضوء الزاهية (الشكل 3D). مع الأشعة فوق البنفسجية دابي، سوف يحمل كيس الجيارديات دابي سلبية تلطيخ، أو دابي إيجابية خصائص الشكل (3E). يتم فحص الكائن فلوري من قبل مدينة دبي للإنترنت لملامح التقليدية وغير التقليدية في بنفس الطريقة التي وصفها لالكريبتوسبوريديوم.إذا لم يكن لاحظ ملامح شاذة، يتم تسجيل الكائن في عدد ايفا الكلي وتصنيفها على أنها هيكل فارغ غير متبلور المحتوية على، أو مع واحد أو أكثر من نوع من الهياكل الداخلية الحالي (الشكل 3F). لا ينبغي لأي كائن أن لوحظ أن لها ميزات شاذة تحسب باعتبارها كيس (س س). ويمكن تحليل مجهري للعينات البيئية تكون صعبة في ظل وجود الكائنات الحية التي يمكن لصناعة السيارات في يتألق أو مع / FITC مترافق ومكافحة الكريبتوسبوريديوم أو المضادة الجيارديات-1 عبر رد فعل الأجسام المضادة. فمن المستحسن أن المحلل أن يكون على دراية الميكروبات المائية وعشرات من استعراض الشرائح لاكتساب الخبرة وتحديد الكريبتوسبوريديوم والجيارديات. لا يقل عن ثلاثة (س س) الخراجات على الشريحة تلطيخ سيطرة إيجابية وينبغي أن يتسم قبل كل جلسة في المجهر. قد تكون ارتفعت عينات مراقبة الجودة مع (س س) الخراجات لتحديد تفصيل في المئةأوفري لكل الأوالي باستخدام الحساب: (س س) نسبة الاسترداد كيس = ((الكونت عينة QC – عد من عينة Unspiked) / سبايك) × 100. الشكل 1. التمثيل البياني للنظام تدفق عرضية الترشيح الفائق جوفاء من الألياف. هو لون الأنبوب مشفرة للمساعدة هو التجمع للنظام. تم صبغ الشكل 2. الممثل صورة مضان من الخراجات (س س) الكريبتوسبوريديوم والجيارديات. بيض التوكسوبلازما الكريبتوسبوريديوم والجيارديات الخراجات مع الأجسام المضادة FITC مكافحة الكريبتوسبوريديوم / الجيارديا المسمى. السهام، والخراجات الجيارديات؛ النصال، بيض التوكسوبلازما الكريبتوسبوريديوم. تم العثور على ما مجموعه أربعة بيض التوكسوبلازما الكريبتوسبوريديوم وستة أكياس الجيارديا في الطائرة من التركيز. عينات observإد تحت 200X التكبير. . الرقم 3 صور مجهرية الممثل من بيض التوكسوبلازما الكريبتوسبوريديوم والخراجات Giaridia المستخدمة لتوصيف بيض التوكسوبلازما الكريبتوسبوريديوم (A – C). رائعة مضان FITC تفاحة خضراء من الكائنات كروي 4-6 ميكرون في القطر مع حواف الضوء الزاهية (A) التي تحتوي على ما يصل إلى أربعة متميزة، نوى دابي السماء الزرقاء (B) و1-4 sporozoites (S) في البيوض المتكيسة (C). الخراجات الجيارديات (D – F). رائعة التفاح الأخضر FITC مضان من جولة إلى كائنات بيضوي الشكل 8-18 ميكرون طويل من قبل 5-15 ميكرون واسع مع حواف الضوء الزاهية (D) التي تحتوي على ما يصل إلى أربعة نوى دابي السماء الزرقاء (E) ومع هيكل واحد أو أكثر داخلي ملحوظ مثل كما نوى (N)، هيئة وسيطة (M) وأو axonemes (A) (F). أبيض السهام، والتفاح الرائعة تلوين بيض التوكسوبلازما مضان أخضر الكريبتوسبوريديوم والجيارديات الخراجات ثALLS؛ النصال أبيض، دابي النوى إيجابية. ولاحظ العينات تحت التكبير 1000X.
Discussion
عرضية تدفق جوفاء من الألياف الترشيح الفائق هي تقنية بديلة وفعالة للتركيز الأولي للبيض التوكسوبلازما الكريبتوسبوريديوم والجيارديات الخراجات من المياه. جوفاء من الألياف الترشيح الفائق هو اقل كلفة من المرشحات التقليدية. حيث أن لديها القدرة على التركيز بيض التوكسوبلازما الكريبتوسبوريديوم والجيارديات الخراجات من مجموعة متنوعة من المصفوفات المياه المختلفة بل هو بديل مفيد للتقنيات الترشيح الحالية المستخدمة لأسلوب وكالة حماية البيئة 1623. كما هو الحال مع معظم وسائل أخرى للترشيح، جوفاء من الألياف الترشيح الفائق هو عرضة للقاذورات مع عينات عكر للغاية. وارتفاع ضغط المياه تنتج عن تلوث مرشح، وبالتالي فمن المستحسن لمراقبة الضغط خلال الفترة السابقة للترشيح. بالإضافة إلى بيض التوكسوبلازما الكريبتوسبوريديوم والجيارديات الخراجات، وقد تبين من الألياف المجوفة الترشيح الفائق لتكون قادرة على التركيز البكتيريا والفيروسات 1-3،5،8. جوفاء من الألياف الترشيح الفائق سويمكن استخدام هذه الطريقة في utlined للتركيز الكائنات متعددة في نموذج واحد. تجدر الإشارة إلى أن الحصول على الحجم النهائي بين 200 و 250 مل هو الخطوة الحاسمة في نهائي الإجراء تركيز بحيث الطرد المركزي خطوات اضافية، والتي قد تؤدي إلى فقدان كيس (س س)، ويتم تجنب (الخطوة 2.2). ومع ذلك، يمكن السماح للحجم في زجاجة لإسقاط منخفض جدا تترك آثارا سلبية على الانتعاش منذ لن يكون هناك حجم السائل ما يكفي لإجبار جميع بيض التوكسوبلازما أو الخراجات في زجاجة retentate. ولذلك فمن المستحسن للحفاظ على الحجم النهائي بين 200 و 250 مل.
حرارة التفكك هو بديل لهذه الخطوة تفكك الحمض الموجود في طريقة 1623. وقد تبين أن هذه الخطوة البديلة لتحسين الكريبتوسبوريديوم انتعاش البيوض المتكيسة والحد من اختلاف الأسلوب عندما عزل من أي نهر أو ماء كاشف 9. أظهرت مقارنة جنبا إلى جنب من الحامض والحرارة طرق تفكك أن استخدام الحرارة لdissociaالشركة المصرية للاتصالات المنتجة للكائنات الحية من الخرز immunomagnetic المستردة أعلى متوسط لكلا الكريبتوسبوريديوم والجيارديات. وبالإضافة إلى ذلك، كان من دقة المبالغ المستردة الكريبتوسبوريديوم والجيارديات أفضل في عينات المجهزة مع تفكك الحرارة مقارنة مع حامض التفكك 9.
إدماج HFUF كخطوة تركيز يسمح بمزيد من المرونة من خلال توفير القدرة على التركيز الكائنات متعددة. وبالإضافة إلى ذلك فهو بديل أقل تكلفة لخيارات الأسلوب الحالي للترشيح 1623.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر آن جريم ومايكل زيمرمان لمراجعة نقدية لهذه المخطوطة وهاملتون دوغ لدعمه التقني.
Materials
| Equipment/Reagent | Vendor | Catalog # |
| Asahi Kasei Rexeed 25 S/R wet hollow-fiber ultrafilters | Dial Medical | REXEED25S/R |
| I/P 73 (Masterflex R-3603), or equivalent | Cole Parmer | EW-06408-73 |
| L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-24 |
| L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-15 |
| L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-36 |
| I/P Precision Brushless Drive | Cole Parmer | EW-77410-10 |
| I/P Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-77601-10 |
| Black HDPE Tee, 1/4″x 3/8″ x 3/8″ | US Plastics | 62064 |
| Masterflex T-connector L/S 15-25 | Cole Parmer | EG-30613-12 |
| Nalgene heavy-duty pp 1 L bottle | Cole Parmer | EW-06257-10 |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11C |
| Nalgene filling/venting cap for 1/4″ tubing, 53B | Cole Parmer | EW-06258-10 |
| Pressure gauge | Cole Parmer | A-680-46-10 |
| Straight coupling, NPT(F), 1/4″ | Cole Parmer | EW-06469-18 |
| NPT branch tee, natural pp | Cole Parmer | A-30610-75 |
| Pinch clamps, 1/2″ | Cole Parmer | EW-06833-00 |
| Custom fit DIN adapters | Molded Products Corp | MPC-855NS.250 |
| Ring stand | Fisher Scientific | 14-670B |
| Ring stand clamps | Fisher Scientific | 05-769-6Q |
| Keck ramp clamp, 14mm | Cole Parmer | EW-06835-10 |
| Sodium polyphosphate | Sigma Aldrich | 305553 |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | 72050 |
| Antifoam Y-30 emulsion | Sigma Aldrich | A5758 |
| Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 |
| 10 L Collapsible high-density polyethylene cubitainer | VWR | IR314-0025 |
| Centrifuge bottle rack | Fisher Scientific | 05-663-103 |
| 250 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430776 |
| Disposable funnel | Cole Parmer | U-6122-10 |
| Wash bottle | Cole Parmer | U-06252-40 |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ARIES SX4750 |
| Centrifuge bucket adapters for 250 ml conical tubes | Beckman Coulter | 349849 |
| 200 μl large bore pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-134 |
| VacuShield Filter | Gelman | 629-4402 |
| 5 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11D |
| Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo kit | IDEXX | 73002 |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 |
| Dynal L10 flat sided tubes | IDEXX | 74003 |
| Timer | VWR | 23609-202 |
| Dynal MPC-6 magnet | IDEXX | 12002D |
| 1 ml pipettes | VWR | 53283-700 |
| 1.5 ml low adhesion microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 |
| 1000 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P1000/DF1000ST |
| 100 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P100/DF100ST |
| 9 inch Pasteur pipettes | VWR | 14672-412 |
| Dynal MPC-S magnet | IDEXX | 12020D |
| Vortex | VWR | 14216-188 |
| Dynabeads rotator mixer | IDEXX | 94701 |
| Heat block | Fisher Scientific | 11-718-2 |
| Lab Armor Beads | Lab Armor | 42370-750 |
| Digital thermometer | Fisher Scientific | 15-077-60 |
| Phosphate-buffer saline 1X pH 7.4 (1X PBS) | Sigma | P4417 |
| Single Spot slides | IDEXX | 30201 |
| Cover glass | Corning | 287018 |
| EasyStain direct kit | BTF | – |
| 10 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P10 & DF10ST |
| 4′,6′-Diamidino-2-phenyl indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | S30697 |
| Methanol | Fisher Scientific | L6815 |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000 |
| slide warmer | Fisher Scientific | 11-474-521 |
| Immersion oil, Type A ND= 1.515 | Nikon | MXA20234 |
| Nikon 90i microscope with DIC capabilities | Nikon | MBA 77000 |
| Plan APO 100X oil objective | Nikon | MRD01901 |
| Plan Achro 20X | Nikon | MRL00202 |
| FITC filter | Nikon | 96302 |
| DAPI filter | Nikon | 96301 |
| X-cite fluorescence illuminator | Nikon | 87540 |
| Lens paper | Nikon | 76997 |
| Biohazard disposable bag | Fisher Scientific | 01-829D |
| Biohazard sharps container | Fisher Scientific | 14-827-117 |
| 3 % hydrogen peroxide | VWR | BDH3540-2 |
| Bleach | Fisher Scientific | 1952030 |
| Wypall | Kimberly Clark | 34790 |
References
- DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952 (2002).
- Hill, V. R., Kahler, A. M., Jothikumar, N., Johnson, T. B., Hahn, D., Cromeans, T. L. Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples. Appl. Environ. Microbiol. 73, 4218-4225 (2007).
- Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Hahn, D., Narayanan, J., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Amburgey, J. E. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6878-6884 (2005).
- Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. E. Comparison of hollow-fiber ultrafiltration to the USEPA VIRADEL technique and USEPA method 1623. J. Environ. Qual. 38, 822-825 (2009).
- Holowecky, P. M., James, R. R., Lorch, D. P., Straka, S. E., Lindquist, H. D. Evaluation of ultrafiltration cartridges for a water sampling apparatus. J. Appl. Microbiol. 106, 738-7347 (2009).
- Lindquist, H. D., Harris, S., Lucas, S., Hartzel, M., Riner, D., Rochele, P., Deleon, R. Using ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples. J. Microbiol. Methods. 70, 484-492 (2007).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. J. Microbiol. Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from. 176, 38-45 (2011).
- Shaw, N. J., Villegas, L. F., Eldred, B. J., Gaynor, D. H., Warden, P. S., Pepich, B. V. Modification to EPA Method 1623 to address a unique seasonal matrix effect encountered in some U.S. source waters. J. Microbiol. Methods. 75, 445-448 (2008).
- Simmons, O. D., Sobsey, M. D., Heaney, C. D., Schaefer, F. W., Francy, D. S. Concentration and detection of Cryptosporidium oocysts in surface water samples by method 1622 using ultrafiltration and capsule filtration. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1123-1127 (2001).
- Sobsey, M. D., Glass, J. S. Influence of water quality on enteric virus concentration by microporous filter methods. Appl. Environ. Microbiol. 47, 956-9560 (1984).
- USEPA. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. Office of Water. 815-R-05-002, (2005).
- Ware, M. W., Wymer, L., Lindquist, H. D., Schaefer, F. W. Evaluation of an alternative IMS dissociation procedure for use with Method 1622: detection of Cryptosporidium in water. J. Microbiol. Methods. 55, 575-583 (2003).
- Zuckerman, U., Tzipori, S. Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices. J. Appl. Microbiol. 100, 1220-1227 (2006).
Tags
Modified EPA Method 1623Tangential Flow Hollow-fiber UltrafiltrationHeat DissociationWaterborne CryptosporidiumGiardia Spp.ProtozoaDiarrheal Disease OutbreaksPrevalenceMonitoringUS Drinking Water SuppliesSample ConcentrationImmunomagnetic Separation ProcedureAcid Dissociation ProcedureImmunofluorescence Staining And EnumerationEnvirochek FiltersEnvirochek HV FiltersFilta-Max Filters
Cite This Article
Rhodes, E. R., Villegas, L. F., Shaw, N. J., Miller, C., Villegas, E. N. A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.. J. Vis. Exp. (65), e4177, doi:10.3791/4177 (2012).