ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב<em> באתרו</em> זלוף של רקמת ריאה וכתמי X-גל של<em> LacZ</emגידול תאים> תייג-
Summary
פרוטוקול הרומן שדווח במחקר הנוכחי מאפשר איתור סלקטיבי של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי שילוב<em> באתרו</em> זלוף ריאות וקיבעון וX-גל הכתמה של<em> LacZ</em> מתויג תאים סרטניים.
Abstract
גרורות הן סיבת מוות העיקרי ברוב סוגי הסרטן, ולכן התמקדות עיקרית בחקר הסרטן. עם זאת, זיהוי של micrometastases ידי radiologic הדמיה וההצלחה במיגור הטיפולי שלהם יישאר מוגבל.
בעוד מודלים של בעלי חיים הוכיחו להיות כלי רב ערך עבור סרטן 1 מחקר, הניטור / ההדמיה של micrometastases עדיין מהווה אתגר והערכה מדויקת של התפשטות גרורה במחקרים פרה פוטנציאלי מוביל לתוצאות מאכזבות בניסויים קליניים 2. כתוצאה מכך, יש עניין רב בשיטות זיקוק לבסוף לאפשר זיהוי לשעתק ואמין של גרורות עד לרמת התא הבודדה ברקמה נורמלית. ההתמקדות העיקרית לכן היא על טכניקות, המאפשרים זיהוי של תאים סרטניים בגוף חי, כמו מייקרו טומוגרפיה ממוחשבת (CT מייקרו), טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), פליטת אור או דימות פלואורסצנטי <sup> 3,4. כרגע אנחנו ייעול שיטות אלה לניטור vivo של גידול ראשוני וגידול בגרורות סרטן עצמות מודלים שונים. כמה טכניקות אלו יכולות גם לשמש לניתוח vivo לשעבר של גרורות לצד שיטות קלסיות כמו qPCR 5, 6 FACS או סוגים שונים של צביעה היסטולוגית. כאמת מידה, הקים במחקר הנוכחי transfection או התמרה של תאים סרטניים עם גן lacZ היציב קידוד חיידקי אנזים β-גלקטוזידאז שחילוף חומרי מצע chromogenic 5-4-כלורו-3-indolyl-beta-D bromo -Galactopyranoside (X-גל) לכחול וסגול, 7 צבע מסיס ומאפשר את הצביעה רגישה מאוד סלקטיבית histochemical הכחולה של תאים סרטניים ברקמת vivo לשעבר עכבר לרמת התא הבודדה, כפי שמוצג כאן. זהו כלי עלות נמוכה ולא ציוד אינטנסיבי, המאפשר אימות מדויקת של גרורות 8 במחקרי ההערכה חדשהטיפולי ticancer 9-11. גורם מגביל של מכתים X-gal הוא ניגודיות הנמוכה לדוגמא כתמי דם אדומים הקשורה ברקמות כלי דם כן. ברקמת ריאת בעיה זו יכולה להיפתר על ידי זלוף ריאות באתרו, טכניקה שהוקמה לאחרונה על ידי Borsig et al. Perfused 12 שריאות של עכברים תחת הרדמה כדי לנקות אותם מהדם ולתקן ולהטמיע אותם באתרו תחת אינפלציה דרך קנה הנשימה. שיטה זו מונעת גם הקריסה של ריאות ובכך שומרת על המורפולוגיה של הריאות alveoli הפונקציונלי, אשר משפר את האיכות של הרקמות לניתוח היסטולוגית. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול חדש, שמנצל את היתרון של שילוב של כתמי X-גל של lacZ-להביע תאים סרטניים ובאתרו זלוף וקיבוע של רקמת ריאה. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מעודן רגישות גבוהה של תאים גרורתי בודדים בריאה ואפשר לנו בשנים האחרונה במחקר לדetect micrometastases "הרדום" ריאה במודל עכבר 13, שתואר במקור להיות שאינם גרורתי 14.
Protocol
Discussion
התוצאות שהוצגו כאן במודל עכבר Dunn/LM8 OS להדגים את כוחה של השיטה החדשה שהוקמה שמשלבת מכתים X-הגל של תאים סרטניים lacZ מתויג-עם זלוף באתרו / קיבוע של רקמת ריאה. זה שילוב של שתי הטכניקות מאפשר גילוי רגישות גבוהה של נגעי micrometastatic עד לרמת התא הבודדה ומשפר גם את ההדמיה של macrometastases על פני הריאות (איור 1), כמו גם בחלקי ריאה (איור 2). בעוד מכתים X-הגל גם מאפשר זיהוי של גרורות (מייקרו) באיברים אחרים, זלוף באתרו / קיבעון משפר את יכולת הגילוי של גרורת מוקדים ברקמות אחרות מאשר הריאה רק במעט בגלל צבע דם ורקמות הקשורה הטבעי 13 איברים אלה. גם אם זלוף מופנה לאיבר אחר, כגון הכבד, הסרת הדם הייתי חלקי בלבד לשפר את הימור הניגודמכתים Ween X-גל והצבע הטבעי של האיבר. עם זאת, השיטה ישימה לכל סוג של lacZ בתיוג תאים סרטניים, באופן דרמטי לשפר את יכולת הגילוי של גרורות ריאות עד לרמה של micrometastases הרדום תא בודד ומאפשר כימות קלה ואמינה של מאקרו וmicrometastases. מגבלה של שיטה זו ואת כל טכניקות האחרות המבוססות על גנים מדווחים, כוללים חלבוני וציפראז וניאון, היא היציבות של ביטוי transgene. כפי שמוצג באיור 2, שלא כל התאים הסרטניים בתוך macrometastatic המוקדים מוכתמים כחול, המעיד על חוסר הפעילות בטא גלקטוזידאז. זה יכול להיות קשור לנימק, אבל זה סביר יותר עקב אובדן ביטוי transgene. הבחנו כי דאן וLM8 התאים יעילים מאוד במורד הוויסות של lacZ ומושתל אחרים גם בבחירה מתמדת לביטוי. לכן החלפנו במחקרים שנעשה לאחרונה לK12 העכבריוK7M2 והוז, 143B האדם וSaOS-2 קווים סלולריים, סרטן העצמות שנשמרה כל ביטוי lacZ יציב במבחנה, כמו גם in vivo עד 100% לאורך זמן.
ברגע lacZ ביטוי יציב מובטח, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת במחקרים בתאים סרטניים מניפולציות גנטיות, למשל מכניסטי לחקור את התהליך של קולוניזציה הרקמה 13, כמו גם לפיתוח והבדיקה של טיפולים החדשים שמטרתה מיגור הגרורות 15 , 16. יתר על כן, הוא יכול לשמש כאמת מידה לשיפור טכניקות נוכחיות רדיולוגיות הדמיה, כגון PET, (מייקרו) CT ו-MRI, המשמשות לגילוי מוקדם של גרורות. במחקר PET האחרון (לא פורסם) עם קליעים נותבים שונים שאומתו בריאה זוהתה vivo גרורות vivo מכן לשעבר עם הפרוטוקול המתואר. במחקר מתמשך עם חיה קטנה חדשה מייקרו-CT (SkyScan) אנחנו כל כך הרבה able לזהות גרורות בריאות בvivo עד גודל של 0.5 מ"מ וvivo לשעבר עד 0.3 מ"מ, אך אנו שואפים ברזולוציה של 0.1 מ"מ. מעניין, זה הוא מגבלת הגודל שאנו קובעים להבחין המאקרו מmicrometastases עם השיטה המשולבת של זלוף באתר ומכתים X-גל. זה מדגיש שוב את הרגישות והתועלת של טכניקה קלה וחסכונית זו.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר Lubor Borsig (מכון לפיזיולוגיה, אוניברסיטת ציריך) בעצתו בטכניקה של זלוף ריאות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מKrebsliga של Kanton ציריך, וולטר ל 'ויוהנה קרן וולף, ציריך, לידיה Hochstrasser הקרן, ציריך, שווייץ הקרן הלאומית למדע, SNF, שוויץ, Schweizerischer Verein Balgrist, והאוניברסיטה של הציר.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
| Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
| Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
| Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
| Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
| Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
| PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
| SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
| Nuclear-Fast Red – Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
| Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 |
Table 1. Reagents and Equipment.
References
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature. 7, 645-658 (2007).
- Coussens, L. M., Fingleton, B., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. Science (New York, N.Y.). 295, 2387-2392 (2002).
- Fass, L. Imaging and cancer: a review. Mol Oncol. 2, 115-152 (2008).
- Puaux, A. L. A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. Int. J. Mol. Imaging. 2011, 321538 (2011).
- Malek, A., Catapano, C. V., Czubayko, F., Aigner, A. A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quantification of metastasis in human xenograft mouse models. Clinical & experimental metastasis. 27, 261-271 (2010).
- Schmidt, C. M. Characterization of spontaneous metastasis in an aggressive breast carcinoma model using flow cytometry. Clinical & experimental metastasis. 17, 537-544 (1999).
- Horwitz, J. P. Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides. J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).
- Kruger, A., Schirrmacher, V., Khokha, R. The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies. Cancer metastasis reviews. 17, 285-294 (1998).
- Arlt, M. Increase in gelatinase-specificity of matrix metalloproteinase inhibitors correlates with antimetastatic efficacy in a T-cell lymphoma model. Cancer research. 62, 5543-5550 (2002).
- Arlt, M. J. Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment. Cancer research. 66, 936-943 (2006).
- Banke, I. J. Effective inhibition of experimental metastasis and prolongation of survival in mice by a potent factor Xa-specific synthetic serine protease inhibitor with weak anticoagulant activity. Thrombosis and haemostasis. 94, 1084-1093 (2005).
- Borsig, L. Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).
- Arlt, M. J. LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis. J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).
- Asai, T. Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung. International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).
- Arlt, M. J. The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity. International journal of cancer. , (2011).
- Steinmann, P. Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma. Cancer. , (2011).
