NADH imagerie par fluorescence de biventriculaire isolé travail coeurs de lapin

1. Configuration pour l'étude Préparer quatre litres de mise à jour de Krebs-Henseleit solution à 16 (en mm: 118 NaCl, KCl 3,30, 2,00 CaCl 2, MgSO 4 1,20, 24,0 NaHCO 3, 1,20 KH 2 PO 4, 10,0 glucose, 2,00 NaPyruvate, et 20,0 mg / L d'albumine ). La solution doit être préparé comme fermer le début de l'expérience que possible. Le pH doit être ajusté à 7,4 après filtration stérile (taille des pores: 22 pm, Corning). Osmolalité de la solution devrait être entre 275 et 295 mOsm / kg. Rincez tous les tubes et les chambres du système coeur de travailler avec de l'eau purifiée. Faire fonctionner les pompes d'eau jusqu'à ce que tout a été retiré du système. Ajoutez des filtres membrane de cellulose (taille des pores: 5 um, Advantec) en ligne avec chacune des pompes de perfusion (pompe à perfusion de Langendorff, à gauche pompe à perfusion cardiaque, et à droite de la pompe de perfusion cardiaque). Effectuer un étalonnage en deux points (0 et 60 mmHg) pour chaque capteur de pression. Tourner sur les bains d'eau. Un bain d'eau chauffée circule (Cole Palmer) est utilisée pour chauffer les tubes chemises d'eau et d'échangeurs de chaleur. Perfusat est pré-chauffé dans un bain d'eau séparée (Oakton Instruments). Deux bains sont mis pour maintenir une température de solution de 37 ° C Activer les pompes pour faire circuler le liquide de perfusion en boucle fermée. Perfusat traverse oxygénateurs microfibre (hémofiltres) gazés avec 95% d'O 2 et 5% de CO 2 à 80 kPa. Perfusat oxygénée s'écoule ensuite à travers des échangeurs de chaleur pour le maintenir à une température de 37 ° C avant d'entrer dans la canule coeur. 2. Excision Coeur Commencer par le réglage du système cardiaque de travail pour fonctionner en mode de pression Langendorff constante. Régler la pression du bloc aortique dans la plage de 50 à 60 mmHg. Anesthésier le lapin avec une injection intramusculaire de kétamine (44 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Après le lapin est sous sédation, le pentobarbital (50 mg / Kg) et de l'héparine (2000 U) est injecté par voie intraveineuse par la veine marginale de l'oreille ou la veine saphène latérale à l'intérieur de la patte postérieure. Lorsque le lapin est entièrement non-réactif, tel que déterminé par une absence de douleur réflexe, la cavité thoracique est rapidement ouvert, le péricarde est tranché, l'aorte est serré, et le cœur et les poumons sont excisées. À ce stade, les poumons doivent être restée attachée au cœur d'aider à isoler les veines pulmonaires. Isoler et cathétériser l'aorte avec une canule diamètre de 5 mm, fixée à une seringue remplie de 60 ml perfusat et 200 unités d'héparine. Fixez l'aorte à la canule avec une suture de soie taille zéro et appuyez lentement la seringue pour vider le coeur de sang. 3. Canulation biventriculaire Branchez le coeur au bloc aortique du coeur du système de travail. Empêcher l'air de pénétrer dans l'aorte, ce qui peut provoquer une embolie coronaire. Il est préférable de fixer la canule à la bl aortiqueock en approchant le connecteur aortique à un angle oblique et permettant perfusat doucement goutte à goutte à partir du connecteur dans la canule tout en elle est attachée. Alors que le coeur est perfusé en mode de pression constante de Langendorff, retirer le tissu adipeux et conjonctif et localiser les vaisseaux suivants: inférieure et la veine cave supérieure, veine azygos, artère pulmonaire, les veines pulmonaires. Ligaturer la veine cave supérieure. Couper l'artère pulmonaire juste en dessous où elle se ramifie dans les artères pulmonaires droite et gauche. Groupe de tous les navires restants (les veines pulmonaires) entre le cœur et les poumons et ligaturer tout faire avec une suture. Retirez les poumons. Découpez un petit trou dans le coin de l'auricule gauche. Veiller à ce que le LA est rempli de liquide de perfusion. Cathétériser le LA tout en s'assurant que la canule est complètement rempli de liquide de perfusion pendant qu'il est inséré. Suturer la canule à l'appendice de Los Angeles. Mettre la pompe de gauche (pompe # 2) pour fournir un débit de til a quitté l'atrium. Régler la pression de précharge entre 2-6 mm Hg et ajuster ± 2 mm Hg, tel que déterminé par la dilatation auriculaire. Mettre le cœur à cœur le mode de travail en désactivant la pompe de Langendorff (pompe # 1). Momentanément diminuer la pression aortique à 10 mm de Hg et ensuite l'augmenter lentement dans la plage de 80 à 100 mmHg. Cela permettra à la valve aortique à ouvrir et à fonctionner comme il le ferait dans des conditions normales physiologiques. La pression postcharge finale dépendra de la contractilité du ventricule gauche. Il doit être réglé à une valeur qui est d'environ 20 mmHg moins que le pic de pression LV. LV cardiaque de sortie peut être déterminée en mesurant le débit de perfusion aortique la sortie du bloc (ml / min). Le débit cardiaque normale est comprise entre 14,77 et 16,43 ml / min pour 100 g de poids corporel et 17 moyennes 340 ml / min pour un lapin 2.2 kg. La pression aortique devrait ressembler le signal de pression de la figure 1. Cathétériser la RA par l'inferior la veine cave. Faire en sorte que tous deux l'RA et la canule sont complètement remplis de perfusat et insérer la canule tout en empêchant la formation de bulles d'air. Suturer la canule de la veine. Mettre la pompe de droite (pompe # 3) pour fournir un débit à l'oreillette droite. Régler la pression à environ 3 mmHg. Assurez-vous que le RV est rempli de liquide de perfusion et de cathétériser l'artère pulmonaire. Faire en sorte que la canule est complètement rempli de liquide de perfusion pendant qu'il est inséré pour empêcher des bulles d'air. Suturer la canule à l'artère pulmonaire. 4. Acquisition du signal: Pressions, potentiels d'action monophasiques et fNADH Une fois canulation biventriculaire est terminée, insérez soigneusement le cathéter capteur de pression (Millar) dans l'aorte par la canule aortique. Doucement à s'y retrouver dans le passé de la valve aortique et dans le LV. Surveiller le signal de pression LV pour assurer un bon positionnement de l'extrémité du cathéter. Un exemple de la pression VG est montréà la figure 1. Appuyez doucement sur l'électrode potentiel d'action monophasique contre épicarde ventriculaire. Surveiller le signal pour atteindre appropriées des mesures de potentiel d'action. Artefact de mouvement légère dans le signal est normal. Placez une électrode de stimulation bipolaire sur l'oreillette droite à stimuler le cœur. Dans notre protocole, les cœurs ont été stimulés à la durée du cycle entre 300 et 150 ms, ce qui correspond à 200 et 400 bpm, respectivement. Mesurez la température de la surface épicardique LV. Si l'étude nécessite que la température soit maintenue à 37 ° C, puis positionner le cœur l'intérieur d'une cavité cardiaque à chemise d'eau ou de plonger au cœur dans un bain chaud superfusat de maintenir une température constante tout au long du coeur. Positionner la caméra CCD (Andor ixon DV860, 128×128 pixels) et focaliser la lentille de telle sorte qu'une zone appropriée de vue est observée. L'appareil photo est connecté à un poste de travail et les images sont acquises à 2 ips en utilisant Andor SOLIS lore. Allumer la lampe lampe au mercure avant le début de formation d'image. La lumière est dirigée à travers un filtre d'excitation (350 ± 25 nm, de la technologie chrominance) et dans un guide de lumière à fibres optiques (Horiba Jobin Yvon modèle 1950-1M) pour éclairer la surface du coeur. L'atténuation de la lumière UV à travers le guide de lumière est faible. Illumination UV pourrait également être fourni en utilisant un système de LED de haute puissance constitué de projecteurs à LED (Mightex PLS-0365-030-S) et une unité de contrôle (SLC-Mightex SA04-Unis). Éteignez la lumière ambiante et minimiser tout l'éclairage ambiant. Visez les embouts du guide de lumière (ou projecteurs à LED) au cœur d'atteindre l'illumination uniforme épicardique. Émise par fluorescence de NADH (fNADH) passe à travers un filtre d'émission (460 ± 20 nm de la technologie chrominance) et est imagée par la caméra CCD. Surveiller les changements au fil du temps fNADH en sélectionnant une région d'intérêt en utilisant le logiciel d'imagerie. Sélectionner vis-à jour en mode pour surveiller l'intensité moyenne des pixels dans le o régionf intérêt. Le cœur doit fonctionner en mode de fonctionnement biventriculaire pour générer des pressions appropriées. niveaux fNADH devrait être faible et stable sur la surface épicardique suffisante pour confirmer la perfusion coronaire. À ce stade de l'étude d'un protocole expérimental spécifique devrait être mis en œuvre pour tester une hypothèse. Lorsque l'étude est terminée, retirez le cœur du système et vider tous les perfusat. Rincer la tubulure du système et des chambres avec de l'eau purifiée. Pour l'entretien de routine, le système doit être périodiquement rincé avec une solution ou une solution Mucasol hydrogène dilué peroxyde, selon les besoins. 5. Off-line de traitement d'images fNADH Une façon de comparer des ensembles de données NADH (fNADH (i, j, t)) entre les expériences consiste à normaliser chaque image de fluorescence à l'aide d'une image de référence (fNADH (i, j, t 0)) à partir de l'ensemble de données 9, comme indiqué dans l'équation ci-dessous . Une autre façon de normaliser NADH fluorescence est de plAs un petit morceau de verre d'uranyle dans le champ de vision avant l'expérience 9, 18, ​​19. Verre d'uranyle va de fluorescence (450 – 550 nm) lorsqu'il est éclairé avec une lumière UV pour fournir un signal qui peut être utilisé comme une référence stable. 6. Les résultats représentatifs Vues antérieures et de la base d'une préparation biventriculaire lapin de travail cardiaque sont présentés dans la figure 1. La pression ventriculaire gauche a été mesurée par la navigation d'un cathéter transducteur de pression (Millar SPR-407) au-delà de la valvule aortique et dans le ventricule gauche. Pressions ventriculaires aortique, artère pulmonaire, et à gauche (LVP) sont présentés dans la figure 1C. Diastolique LVP est généralement comprise entre 0 et 10 mmHg. La pression aortique diastolique minimale est d'environ 60 mmHg. Pic systolique LVP dépend de la pression de remplissage (la précharge ou de la pression LA) et de la contractilitéet, de façon optimale, doit être comprise entre 80 et 100 mmHg. La pression aortique maximal et LVP doit correspondre étroitement, comme le montre la figure 1C. Potentiels d'action monophasiques (MAP) avec une phase de dépolarisation rapide et une phase de repolarisation qui sont typiques pour des cœurs de lapins sont présentés dans la figure 1D. Les cartes peuvent être enregistrées relativement facilement à partir d'un coeur traitance mais ont généralement un artefact de mouvement petite pendant la diastole, comme indiqué dans la figure 1D. Cartes sont utiles pour confirmer l'entraînement avec succès du cœur (la capture) au cours de la stimulation et peut également être utilisé pour mesurer les changements électrophysiologiques locales dues à une ischémie ou d'autres perturbations de courte durée. Un ECG peut également être mesurée par une immersion au coeur dans un bain de superfusat chaude et placer une électrode dans le bain sur les côtés gauche et droit du cœur. Un troisième électrode indifférente est soit placé dans le bain, à l'écart du coeur, ou est attaché à l'aorte.Un ECG fournira des informations concernant l'excitation mondiale et le processus de repolarisation, ce qui est utile pour évaluer l'ensemble de fonction électrique et pour révéler la présence d'une ischémie. fNADH imagerie révèle des changements dans l'état redox mitochondrial du cœur, qui peuvent être utilisés pour mesurer la progression spatio-temporelle des régions ischémiques ou hypoxiques. Pour cette étude, épicardique fNADH a été mesurée pour surveiller les changements dans l'état d'oxydo-réduction au cours des trois fréquences de stimulation à la durée du cycle (CL) de 300, 200 et 150 msec. Les valeurs moyennes fNADH d'une région d'intérêt (encadré rouge, figure 2) montrent que les niveaux de référence fNADH augmenter à mesure que la durée du cycle est raccourci. Lorsque la fréquence de stimulation est proche d'un rythme sinusal (CL = 300 msec) de base fNADH niveau est relativement constant. Comme la durée du cycle est raccourci en dessous de 300 ms, base fNADH l'augmentation des niveaux, avec la plus forte augmentation dans les plus brefs CL (150 msec). Haute résolution fNADH imagerie de la surface totale antérieureà 200 et 400 bpm est illustré à la figure 3. niveaux fNADH à 200 bpm étaient constants et spatialement homogène. A 400 bpm, le niveau a considérablement augmenté tout au long fNADH l'épicarde. Importante hétérogénéité spatiale a été observée avec les plus fortes hausses se trouvant dans les régions septales de la RV et LV. Le signal fNADH oscille avec la contraction (artefact de mouvement) et la fréquence d'oscillation correspond à la fréquence cardiaque (figure 2). En canulation biventriculaire, la base du cœur est détenu par 4 canules, ce qui contribue à empêcher le cœur de balancer pendant la contraction. Par conséquent, l'amplitude d'oscillation est toujours inférieure à n'importe quelle échelle de temps plus (5-10 sec) les tendances dans fNADH qui sont causées par une ischémie ou l'hypoxie. Figure 1. Pressions typiques et des potentiels d'action monophasiques à partir d'un travail isolé biventriculaire racoeur bbit. A. Vue basale du cœur montrant les canules de quatre: 1, aortique, 2, artère pulmonaire; 3, de l'oreillette gauche, et 4, de l'oreillette droite B. Vue antérieure du cœur montrant le ventricule gauche (VG) et le ventricule droit. (RV) pressions représentatives. C.. Top: la pression ventriculaire gauche (trait plein) et la pression aortique (ligne pointillée). En bas: la pression artérielle pulmonaire. D. potentiels représentatifs d'action monophasiques. Le signal est aligné avec les pressions indiquées dans le panneau C. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 2. imagerie fNADH d'un actif isolé biventriculaire coeur de lapin. Haut: Une bande dessinée du champ de vue (à gauche) et trois images fNADH sont présentés. La longueur de stimulation correspondant cycle (CL) est indiqué sur chaque image.La région d'intérêt pour le signal fNADH dans le panneau inférieur est indiquée par la boîte de rouge. La pointe de l'électrode de potentiel d'action monophasique est vu à droite de la région d'intérêt. L'épicarde a été allumé à l'aide de la lampe au mercure et guide de lumière, comme le montre la Figure 5. Seule la surface épicardique entourant la région d'intérêt a été illuminé Bas:. FNADH moyen pour la région d'intérêt indiqué par la boîte rouge dans le panneau supérieur. Moyenne des augmentations fNADH avec une longueur de cycle réduit. Figure 3. images fNADH de toute la surface antérieure d'un actif isolé biventriculaire coeur de lapin. Le cœur était au rythme de la RA à 200 bpm et 400 bpm. fNADH a été imagé (2 ips, 128×128 pixels à une résolution de 0,4 mm) tout en éclairant l'épicarde toute antérieure au moyen de deux LED de puissance élevée (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% intensity, 50 mW max).