عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف
Summary
وصفنا طريقة لتنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف باستخدام السائل التعامل مع الروبوتات. هذه الطريقة تنطبق بصورة عامة على تنقية الصغيرة من البروتينات القابلة للذوبان صاحب الموسومة في شكل عالية الإنتاجية.
Abstract
البلورات بالأشعة السينية هو الطريقة المفضلة للحصول على عرض تفصيلي لبنية البروتينات. مثل هذه الدراسات تحتاج إلى أن تستكمل التحليلات الكيميائية الحيوية للحصول على مزيد من الأفكار التفصيلية في هيكل / وظيفة العلاقات. التقدم في تكنولوجيا توليف الجينات وقليل النوكليوتيد جعل استراتيجيات الطفرات واسعة النطاق من الممكن أكثر فأكثر، بما في ذلك استبدال بقايا الهدف من جميع الأحماض الأمينية الأخرى 19. مكسب أو خسارة، من بين الظواهر الدالة تسمح ثم لابد من استخلاص استنتاجات منهجية، مثل مساهمة خاصة لمخلفات النشاط التحفيزي الاستقرار البروتين، و / أو البروتين البروتين خصوصية التفاعل.
من أجل أن تنسب الظواهر المختلفة لطبيعة الطفرة – بدلا من تقلب الظروف التجريبية – من المهم جدا لتنقية وتحليل البروتينات بطريقة يمكن التحكم بها وقابلة للتكرار. عالية الإنتاجية واستراتيجيات أتمتة البروتوكولات دليل علىخلقت الروبوتية معالجة السائل منصات الفرص لتنفيذ هذه الإجراءات المعقدة الجزيئية البيولوجية مع تدخل بشري قليلا ومعدلات الخطأ الحد الأدنى من 1-5.
هنا، نقدم طريقة عامة لتنقية البروتينات المؤتلف صاحب الموسومة بطريقة عالية الإنتاجية. في دراسة حديثة، طبقنا هذا الأسلوب لتحقيق هيكل الوظائف مفصلة من TFIIB، وهو مكون من آلات النسخ القاعدية. أمر لا غنى عنه لTFIIB النسخ المروج-الموجهة في المختبر، كما أنها ضرورية لتوظيف بوليميراز RNA إلى مجمع preinitiation 6-8. TFIIB يحتوي على رابط مجال المرنة التي تخترق موقع نشط شق من بوليميريز RNA 9-11. يمنح هذا المجال رابط نشاطين قابلة للقياس الكمي كيميائيا على TFIIB، أي (أنا) وتحفيز للنشاط الحفاز خلال المرحلة 'فاشلة' من بدء النص، و (الثاني) مساهمة إضافية إلىمحددة بوليميريز RNA توظيف في preinitiation معقدة 4،5،12. نحن استغلال طريقة تنقية عالية الإنتاجية لتوليد واحدة، استبدال مزدوجة وثلاثية والحذف الطفرات داخل رابط TFIIB وتحليل في وقت لاحق لهم في المقايسات الفنية للتأثير على تحفيز النشاط التحفيزي للبوليميراز RNA 4. تماما، ونحن ولدت، وتنقية وتحليل طفرات 381 – وهي مهمة كان يمكن أن يكون وقتا طويلا وشاقة لأداء يدويا. أنتجنا ويعاير البروتينات في multiplicates التي سمحت لنا أن نقدر أي اختلافات التجريبية وقدم لنا فكرة واضحة عن تكرار نتائجنا.
هذه الطريقة بمثابة بروتوكول عام لتنقية البروتينات، وصاحب الموسومة وقد استخدم بنجاح لتنقية البروتينات المؤتلف أخرى. هو الأمثل حاليا هو لتنقية البروتينات من 24 ولكن يمكن تكييفها لتنقية البروتينات تصل إلى 96.
Protocol
Discussion
وتنقية البروتين المؤتلف الآلي الطريقة الموضحة هنا يسمح للإنتاج وتنقية لعدد كبير من البروتينات الطافرة في شكل صغير الحجم للغاية في ظل ظروف استنساخه مع الحد الأدنى من التدخل البشري. الشكلان 1 و 2 من النتائج عرض منهجية ضوابط الجودة وأمثلة من تنقية البروتينات. الشكل 3 يبين أن عوامل النسخ تنقية المستخدمة في هذا المثال تنفيذ استنساخه بطريقة غاية في المقايسات الفنية.
على الرغم من وضعت إجراءات لتنقية TFIIB archaeal، فإنه ينطبق على نطاق واسع لتنقية البروتينات تقارب الموسومة. فإن استخدام مثل هذه البروتوكولات تنقية الآلي مما يسهل كثيرا من التحليل الكيميائية الحيوية للبروتينات المؤتلف وسيعزز بالتالي من فهمنا للبروتين البروتين التفاعلات على نطاق ويصعب تحقيق يدويا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل على منحة المشروع ويلكوم (078043/Z/05/Z) لROJW
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Overnight Express Instant TB Medium | Merck Chemicals Ltd | 71491-4 | |
| FastBreak | Promega Ltd. | V8573 | |
| Lysonase Bioprocessing Reagent/ 1 ml | Merck Chemicals Ltd | 71230 | |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Company Ltd | A6426 | |
| MagneHis Ni-Particles | Promega | V8565 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich Company Ltd | 56750 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich Company Ltd. | 93362 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Bicinchoninic Acid protein determination | Sigma-Aldrich Company Ltd | BCA1-1KT | |
| Deep Well Plate 2.2 ml Square Wells PP pk10 | Anachem Ltd | 1810-00 | |
| Microplate MicroWell 96 well flat bottom polystyrene not treated 12 sleeves of 5 plates clear 0.4 ml well volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc | Fisher Scientific Ltd. | DIS-984-090M | |
| Microplate Blue | VWR | NUNC367001 | |
| 24-Well Blocks RB (24) | Qiagen | 19583 | |
| Guanidine hydrochloride | VWR | ALFAA13543.0B | |
| Washable needle for TheOnyx | Aviso GmbH | 8152-317001 | |
| Reagent Rack for Magnetic Beads | Aviso GmbH | 8152-035003 | |
| Plate Reader Synergy HT | BioTek | 4200-000043 | |
| Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 | Aviso GmbH | 8145-050046 | |
| Microplate Shaker Variomag Teleshaker | Inheco | 3800047 | |
| 96-well Magnet Type A | Qiagen | 36915 |
References
- Weinzierl, R. O. The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain. BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).
- Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes. Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).
- Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases. J. Biol. 7, 40 (2008).
- Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions. Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).
- Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. Revealing the Function of TFIIB. Transcription. , (2011).
- Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. Basal and regulated transcription in Archaea. Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).
- Parvin, J. D., Sharp, P. A. DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II. Cell. 73, 533-540 (1993).
- Tyree, C. M. Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II. Genes. 7, 1254-1265 (1993).
- Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).
- Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism. Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).
- Kostrewa, D. RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation. Nature. 462, 323-330 (2010).
- Werner, F., Weinzierl, R. O. Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors. Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).
