Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에
Summary
기능과 midbrain dopaminergic 뉴런의 발달 동안 유전자의 규정을 평가하기 위해 관련된 방법을 설명<em> 비켜에서</em배아 병아리 복부 midbrain의 dopaminergic 신경 세포의 progenitors로 플라스미드의 DNA 구조의> electroporation. 이 기술은 midbrain 개발 및 dopaminergic 신경 세포의 분화의 다양한 측면을 연구하는 데 관심있는 유전자의 효율적인 표현을 달성하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
복부 midbrain 제어 운동에 위치 Dopaminergic 뉴런, 정서적 행동, 및 보상 메커니즘 1-3. 복부 midbrain dopaminergic 신경 세포의 기능 장애는 파킨슨병, 정신 분열증, 우울증 및 치매 1-5 연관되어 있습니다. 따라서, midbrain dopaminergic 신경 세포의 분화의 조절을 연구하는 것은 midbrain 개발 및 신경 전구 운명 사양을 조절 메커니즘에 중요한 통찰력을만을 제공할 수 없습니다뿐만 아니라, 인간의 신경 장애의 다양한 치료를위한 새로운 치료 전략을 개발하는 데 도움이됩니다.
Dopaminergic 뉴런은 배아 복부 midbrain의 심실 영역에 즐비한 신경 progenitors에서 차별화. 신경 progenitors의 개발은 유전자 발현 프로그램 6,7에 의해 제어됩니다. 여기 (일 햄버거 해밀턴 (HH) 무대 11 midbrain에서 구체적으로 유전자를 표현하는 electroporation을 활용한 기술을보고irteen somites, 42 시간) 여자는 배아 8,9. 여자는 태아의 외부 개발은 나중에 발달 타임 포인트 10-13에서 결정된 효과를 특정 배아 단계에서의 편리하고 실험적인 조작을 위해 수 있습니다. 이전 HH 스테이지 13 (열아홉 somites 48 시간)보다 칙 배아 신경 튜브는 신경 시스템의 서로 다른 세포 유형으로 구별 능력이있다 multipotent 신경 progenitors로 이루어져 있습니다. CMV 프로 모터와 여자는 β-actin 향상제 모두 포함 pCAG 벡터는 국기 또는 배아 병아리 신경 튜브 14 기타 에피토프 태그가 추가된 구조의 강력한 표현을 허용합니다. 이 보고서에서 우리는 유전자가 배아 midbrain 지역으로 구체적으로 구성하고 어떻게 소규모 맞춤 전극과 electroporation를 정확하게하는 투입 방법을 포함하여 배아 midbrain dopaminergic 신경 세포의 progenitors에서 지역 제한된 유전자 발현을 달성할 수 있도록 특별한 조치를 강조한다. C 분석나중 단계에서 시골 midbrain는 플라스미드 벡터 중재의 이득의 기능 및 midbrain 개발 손실의 기능 연구를위한 생체내 시스템에 탁월한를 제공합니다. 실험 시스템의 변경은 운명 매핑 분석을 수행과 유전자 발현의 규정을 조사하는 신경계의 다른 부분에 검정을 연장할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
태아의 여자는 midbrain의 비켜 electroporation의는 낮은 비용과 midbrain dopaminergic 신경 세포 개발의 유전자 기능의 생체내 연구에서 수행하는 유전자 변형 또는 녹아웃 동물의 생성에 대한 빠른 대안을 제공합니다. 배아 midbrain 특정 DNA를 주입 함께 짧은 2mm에게 패 모양의 긴 백금 전극을 사용하면 midbrain dopaminergic 신경 세포의 progenitors에 대한 관심의 유전자의 효율적인 표현을 달성하기위?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 pCAG-mCherry가 만들지 제공해 주셔서 박사 Takahiko 마츠다 감사드립니다. YCM은 Schweppe 재단의 경력 개발 대상과 관청 재단의 교부금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
References
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