Een fluorescentie<em> In situ</em> Hybridisatie (FISH)-methode is ontwikkeld om visueel te detecteren virale genoom RNA met behulp van fluorescentie microscopie. Een sonde wordt met specificiteit voor de virale RNA die vervolgens kan worden geïdentificeerd door een combinatie van hybridisatie en immunofluorescentie technieken. Deze techniek biedt het voordeel dat het identificeren van de lokalisatie van het virale RNA of DNA bij steady-state, het verstrekken van informatie over de controle van intracellulaire virus mensenhandel evenementen.
Virussen die cellen infecteren oproepen specifieke wijzigingen in de normale celfuncties, die dienen om energie en grondstoffen af te leiden voor virale replicatie. Veel aspecten van de gastheercel functie worden gevorderd door virussen, meestal door de expressie van virale gen-producten die werven gastheercel eiwitten en machines. Bovendien, virussen ingenieur specifieke membraan organellen of tag op de mobiele blaasjes en motor eiwitten aan de regio's van de cel (tijdens de novo infectie, virussen coöpteren moleculaire motor eiwitten aan de kern richten richten, later, tijdens de montage virus, zullen ze kapen cellulaire machinerieën die zal helpen bij de assemblage van virussen). Minder is wel te verstaan over de manier waarop virussen, met name die met een RNA genoom, het coördineren van de intracellulair verkeer van zowel eiwit-en RNA-componenten en hoe ze te bereiken montage van infectieuze deeltjes op specifieke loci in de cel. De studie van RNA lokalisatie begon in eerder werk. Het ontwikkelen van een lagere eukaryote embryos en neuronale cellen die belangrijke biologische informatie, en ook gewezen op het belang van RNA lokalisatie in de programmering van genexpressie cascades. Het onderzoek in andere organismen en cel systemen heeft geleid tot soortgelijke belangrijke informatie. Virussen zijn obligate parasieten en moeten gebruik maken van hun gastheercellen te repliceren. Zo is het essentieel te begrijpen hoe RNA virussen de RNA-genomen richting van de kern via de nucleaire poriën door het cytoplasma en aan een van zijn eindbestemming, in voorloper virusdeeltjes 1.
FISH dient als een nuttig hulpmiddel om veranderingen in de steady-state lokalisatie van viraal RNA te identificeren. In combinatie met immunofluorescentie (IF) analyse 22, VIS / IF co-analyses zullen informatie geven over de co-lokalisatie van eiwitten met het virale RNA 3. Deze analyse geeft daarom een goed uitgangspunt om voor RNA-eiwit interacties te testen door andere biochemische of biofysischetest 4,5, omdat co-localisatie is op zichzelf niet genoeg bewijs om zeker te zijn van een interactie. Bij het bestuderen van viraal RNA lokalisatie met behulp van een methode als deze is, heeft veel informatie opgedaan op zowel virale en cellulaire RNA handel gebeurtenissen 6. Bijvoorbeeld, HIV-1 RNA produceert in de kern van geïnfecteerde cellen, maar de RNA alleen vertaald in het cytoplasma. Wanneer een toets viraal eiwit ontbreekt (Rev) 7 is FISH van het virale RNA gebleken dat het blok van virale replicatie door het behoud van de HIV-1 RNA genomische in de kern 8.
Hier wordt de gevolgde methode voor visuele analyse van genomisch viraal RNA in situ. De methode maakt gebruik van een gelabeld RNA probe. Deze sonde is ontworpen om een aanvulling op het virale genoom RNA. Tijdens de in vitro synthese van de antisense RNA probe de ribonucleotide die is gemodificeerd met digoxigenine (DIG) is opgenomen in een in vitro transcription reactie. Zodra de probe gehybridiseerd is de doel-mRNA in cellen worden vervolgens antilichaam labeling stappen (figuur 1) tonen de lokalisatie van de mRNA en eiwit van belang bij het uitvoeren FISH / IF.
FISH / IF co-analyse is een betrouwbare methode om virale RNA te visualiseren in cellen die nu is geraffineerd 9,15,16. In de loop van enkele jaren, hebben we een verfijndere methode van kleuring voor RNA. Deze techniek kan worden gebruikt op een groot aantal celtypes die de sonde specifiek voor het doel RNA 17. Door het labelen van de sonde met DIG, zijn wij in staat het visualiseren van de RNA door eenvoudige kleuring. Wanneer kleuring voor RNA en andere eiwitten worden gecombineerd, FISH / IF co-analyses uitgegroeid tot een krachtig instrument om cellulaire structuren en eiwit / RNA-lokalisatie te observeren.
De specificiteit van de RNA detectie vrij hoog. Dit wordt geïllustreerd in figuur 2. In een deel van het originele werk dat zich richtte op virale genoom RNA lokalisatie, FISH vastgesteld dat een gebrek aan Rev viraal RNA gevangen in de kern 18. Aangezien dit is, heeft veel nieuwe informatie over virale genoom RNA lokalisatie is verkregen met behulp van de technique hier beschreven. Door overexpressie cellulaire eiwitten kunnen specifieke groepen en niet alle van het virale RNA gedwongen lokaliseren verschillende gebieden van de cel. RILP overexpressie, die lijkt op de fenotype verkregen wanneer hnRNP A2 is uitgeput door siRNA in HIV-1-expresserende cellen 13, waardoor de RNA zichtbaar ophopen op de MTOC. De virale genoom RNA kan worden geduwd om de cel omtrek uitschakelen van de min-end motor eiwit dyneine: p50/Dynamitin overexpressie of knockdown van de zware keten dyneine 1 resulteert in het vrijkomen van virale genoom RNA van intracellulaire domeinen van de cellulaire periferie ( Figuur 2). Een mutant van RILP, RILPΔN, die niet meer bindt de dyneine motor, verspreidt endosomen (getagged door LAMP1) in het cytoplasma, omdat ze niet meer actief gelokaliseerd in juxtanuclear domeinen. Deze resultaten wijzen op het idee van een plastic populatie van HIV-1 RNA genoom en in het bijzonder, dat verschillende zwembaden van HIV-1 genoomRNA bestaan soms identificeerbare rollen in de virale replicatie cyclus. Dezelfde begrippen zijn reeds aangegeven voor het eiwit gecodeerd door dit mRNA, Gag 19.
Er zijn beperkingen aan het gebruik van FISH / IF co-analyses die zijn gerelateerd aan antilichaam keuze en beschikbaarheid. De optimalisatie van de beste combinatie van primaire en secundaire antilichamen, en de concentraties daarvan, zal de tijd nemen om te optimaliseren (zie tabel 1 & 2). Antilichamen gemaakt van hybridoma of geproduceerd door grote bedrijven kan hebben concentraties die overal variëren van 1:2 tot 1:2000, maar zorg ervoor dat de richtlijnen van de fabrikant voor het beste resultaat te volgen. De gastheer waarin het antilichaam geproduceerd moet worden overwogen. Mengen schapen met geit antilichamen moet worden vermeden in primaire en secundaire antilichamen als deze combinatie hoge achtergrond door cross-soortherkenning (gegevens niet getoond). Voor de Alexa-Fluor secondary antilichamen, kan de concentratie worden gebruikt 1:500 bijna elk antilichaam in de toestel. De andere nadeel van FISH / IF co-analyses, zoals beschreven in dit rapport is het vangt de RNA op de locatie bij steady-state, na cellen zijn gefixeerd en doorlaatbaar gemaakt met behulp van paraformaldehyde en wasmiddel (Figuur 1).
Er is echter RNA-imaging in levende cellen is bereikt door een verscheidenheid aan middelen 20-22, meestal in varianten van de virale RNA-genomen die zijn voorzien van tag door fluorescerende eiwitten zoals GFP. Echter aanvullende middelen om RNA-lokalisatie te identificeren in levende cellen blijven aan de oppervlakte. Deze nieuwe methoden betrekking op de tagging RNA door middel van Spinazie 23, SNAP 24, of MTRIP 2. Deze technieken lijden enkele nadelen waaronder de vereiste cellen permeabilize voor toevoeging substraten of een groep worden geconstrueerd om de mRNA labelen te detecteren mRNA microscopie. Immers de belangrijkste ADVAntage van FISH analyse beschreven in dit rapport ligt in het feit dat de natieve RNA ongewijzigde leidt tot de fysiologisch relevante resultaten.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken verleden en huidige leden van het lab voor bijdragen aan de ontwikkeling van de methodiek die hier geschetst en Alan Cochrane voor advies. LA is een ontvanger van een Canadese Institutes of Health Research (CIHR) Doctoral Fellowship en AJM wordt ondersteund door een Fraser, Monat en MacPherson Career Award. Dit werk wordt ondersteund door een subsidie van het CIHR (subsidie # MOP-56974).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
18mm coverslips | VWR | 48380 046 | |
16% paraformaldehyde | J.T. Baker | S898-07 | To make 4%: Dissolve 20g in 500mL 1XDPBS at 60°C with 5 drops NaOH. pH to 7.2 off the heat and store at -20 °C. Do not exceed 70°C! |
Triton-X | OmniPur | 9400 | |
Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche | D6294-02 | |
DIG RNA Labelling Mix | Roche | 11277073910 | |
Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | |
Quick Spin Columns | Roche | 11814427001 | |
DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
1X DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Formamide | EMD | FX0420-8 | |
tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche | 1768506 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | |
Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | |
Microslides | VWR | 48300-047 | |
Immunomount | Thermoscientific | 9990402 |
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) | Colours | Alexa Fluor used (1:500) |
Mouse (1:500;Sigma, B7405) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571) | |
Sheep (1:200;Roche, 11376623) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448) |
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations.