ومضان<em> في الموقع</emوقد وضعت> تهجين (FISH) طريقة للكشف عن الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي بصريا باستخدام المجهر مضان. يتم إجراء تحقيق مع خصوصية لRNA فيروسي ومن ثم يمكن تحديدها باستخدام مزيج من تقنيات التهجين والمناعي. هذه التقنية توفر ميزة التعرف على توطين RNA فيروسي أو الحمض النووي في الدولة ثابتة، وتوفير المعلومات بشأن التحكم في الخلايا أحداث الاتجار فيروس.
Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8.
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.
FISH / إذا شارك في تحليل هو طريقة يمكن الاعتماد عليها لتصور RNA فيروسي في الخلايا التي تم الآن صقلها 9،15،16. على مدى عدة سنوات، قمنا بتطوير أسلوب راق في تلطيخ عن الحمض النووي الريبي. ويمكن استخدام هذه التقنية في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا المقدمة وهذا التحقيق هو محدد لهدف الجيش الملكي النيبالي 17. وذلك عبر تسمية لجنة التحقيق مع مجموعة دبي للاستثمار، ونحن قادرون على تصور بواسطة الحمض النووي الريبي تلطيخ بسيط. عندما يتم الجمع بين تلطيخ عن الحمض النووي الريبي والبروتينات الأخرى، FISH / إذا شارك في تحليل تصبح أداة قوية لمراقبة الهياكل الخلوية وتوطين بروتين / الحمض النووي الريبي.
خصوصية الكشف عن الحمض النووي الريبي عالية جدا. ويتضح هذا في الشكل 2. في بعض الأعمال الأصلية التي تركز على الفيروس الجيني RNA الترجمة، والأسماك المنشأة أن عدم وجود رؤيا المحاصرين RNA الفيروسي في نواة 18. منذ هذا، وقد تم الحصول على معلومات جديدة وفيرة في الجينوم الفيروسي RNA الترجمة باستخدام الاسلوبورد ه هنا. بواسطة البروتينات الخلوية overexpressing، يمكن أن تضطر السكان ومحددة ليس كل من الحمض النووي الريبي الفيروسي في توطين إلى مناطق مختلفة من الخلية. حصلت RILP overexpression، الذي يشبه النمط الظاهري عندما يتم استنفاد hnRNP A2 بواسطة سيرنا في HIV-1-معربا عن الخلايا 13، يؤدي إلى تراكم الحمض النووي الريبي واضح في MTOC. ويمكن دفع الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي على هامش الخلية عن طريق تعطيل بروتين المحركات ناقص النهائيين، داينين: overexpression p50/Dynamitin أو ضربة قاضية لالثقيلة النتائج داينين 1 سلسلة في الإفراج عن الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي من المجالات بين الخلايا لهامش الخلوية ( الشكل 2). متحولة من RILP، RILPΔN، التي لم تعد تربط محرك داينين، يشتت الإندوسومات (الموسومة بواسطة LAMP1) إلى السيتوبلازم لأنها لم تعد بنشاط ممركزة في المجالات juxtanuclear. هذه النتائج تشير الى فكرة وجود سكان من البلاستيك HIV-1 الحمض النووي الريبي الجينومية وعلى وجه الخصوص، أن مختلف برك من الجينومية-1 فيروس نقص المناعة البشريةالجيش الملكي النيبالي موجودة مع أدوار محددة في بعض الأحيان في دورة تكاثر الفيروس. وقد تم بالفعل هذه الأفكار نفسها التي حددت لهذا البروتين المشفرة بواسطة مرنا، الكمامة 19.
هناك قيود على استخدامات FISH / إذا شارك في التحليلات التي ترتبط خيار الأجسام المضادة ومدى توافرها. والاستفادة المثلى من أفضل مزيج من الاجسام المضادة الابتدائية والثانوية، وتركيزاتها، يستغرق وقتا طويلا لتحسين (أنظر الجدول رقم 1 و 2). يمكن أن الأجسام المضادة التي من hybridomas أو التي تنتجها الشركات الكبرى لديها تركيزات التي تختلف في أي مكان من 01:02 إلى 1:2000، ولكن يجب التأكد من اتباع الإرشادات المقدمة من قبل الشركة المصنعة للحصول على أفضل النتائج. ويجب أيضا المضيف الذي يتم انتاجه في الجسم المضاد يؤخذ قيد النظر. وينبغي أيضا الأغنام الاختلاط مع الأجسام المضادة الماعز يمكن تجنبها في الأجسام المضادة الأولية والثانوية مثل هذه النتائج في مجموعة خلفية عالية نظرا لعبور الأنواع اعتراف (لا تظهر البيانات). لاليكسا، فلور secondaالأجسام المضادة راي، يمكن استخدام تركيز على الأجسام المضادة لل1:500 أي تقريبا في المجموعة. والعيب الآخر لصيد السمك / إذا شارك في التحليلات على النحو المبين في هذا التقرير هو أنه يلتقط الجيش الملكي النيبالي في موقعه في الدولة، ثابت، بعد أن يتم إصلاح الخلايا وpermeabilized باستخدام امتصاص العرق والمنظفات (الشكل 1).
ومع ذلك، فقد تم تحقيق RNA التصوير في الخلايا الحية من خلال مجموعة متنوعة من الوسائل 20-22، معظمها باستخدام أشكال مختلفة من الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي الذي يتم تمييزها من البروتينات الفلورية مثل GFP. ومع ذلك، وسائل إضافية لتحديد الحمض النووي الريبي التوطين في الخلايا الحية لا تزال تطفو على السطح. هذه الطرق الجديدة تنطوي على الحمض النووي الريبي عن طريق وضع علامات السبانخ 23، SNAP 24، أو MTRIP 2. هذه التقنيات أيضا يعانون من عدد قليل من العيوب بما في ذلك شرط لpermeabilize الخلايا قبل ان يضيف ركائز أو على وجوب هندسيا شاردة لوضع علامة على مرنا من أجل الكشف عن مرنا بواسطة المجهر. في الواقع، وأدفا الرئيسيةntage التحليلات الأسماك الواردة في هذا التقرير تكمن في حقيقة أن الحمض النووي الريبي الأم هي دون تغيير مما يؤدي إلى نتائج أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية.
The authors have nothing to disclose.
الكتاب أشكر أعضاء في الماضي والحاضر من مختبر للمساهمات في تطوير منهجية المبينة هنا وآلان كوكرين للحصول على المشورة. لوس انجليس هي المستفيدة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) زمالة الدكتوراه وAJM معتمد من قبل جائزة شهادة فريزر، Monat وماكفيرسون. ويدعم هذا العمل عن طريق منحة من CIHR (منحة # MOP-56974).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
18mm coverslips | VWR | 48380 046 | |
16% paraformaldehyde | J.T. Baker | S898-07 | To make 4%: Dissolve 20g in 500mL 1XDPBS at 60°C with 5 drops NaOH. pH to 7.2 off the heat and store at -20 °C. Do not exceed 70°C! |
Triton-X | OmniPur | 9400 | |
Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche | D6294-02 | |
DIG RNA Labelling Mix | Roche | 11277073910 | |
Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | |
Quick Spin Columns | Roche | 11814427001 | |
DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
1X DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Formamide | EMD | FX0420-8 | |
tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche | 1768506 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | |
Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | |
Microslides | VWR | 48300-047 | |
Immunomount | Thermoscientific | 9990402 |
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) | Colours | Alexa Fluor used (1:500) |
Mouse (1:500;Sigma, B7405) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571) | |
Sheep (1:200;Roche, 11376623) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448) |
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations.