En electroporación in vitro del labio inferior rómbico mitad de la gestación de embriones de ratón
Summary
Este estudio describe el desarrollo de un<em> In vitro</emTécnica> electroporación, que permite la manipulación de la expresión génica en el labio inferior rómbica mitad de la gestación de los embriones.
Abstract
El labio rómbico es un neuroepitelio embrionario localizado en el cerebro posterior en la unión entre el tubo neural y la roofplate del cuarto ventrículo (revisado en 1). El labio rómbico puede subdividirse en el labio superior romboidal (URL), que abarca rhombomere 1 (R1) y genera las neuronas del cerebelo y el labio inferior rómbica (LIF), que da lugar a diversos linajes neuronales del tronco cerebral 2-4. LRL incluyen los derivados de las neuronas auditivas de los núcleos cocleares y los de los núcleos precerebellar que están involucrados en la regulación del equilibrio y el control del motor 5.8. La neurogénesis de la LIF se produce a través de una gran ventana temporal que abarca embrionarias día (E) 9,5 a 16,5 5, 9. Diferentes linajes neuronales emergen de la LIF, como las células posmitóticas (o nacen) durante distintos días de desarrollo durante esta ventana neurogénica.
La electroporación de construcciones de expresión de genes puede ser usado paramanipular la expresión génica en células progenitoras LRL y, potencialmente, puede cambiar el destino de las neuronas que se producen en esta región 10-12. La alteración de la expresión génica de células progenitoras LRL en el ratón mediante electroporación en el útero ha tenido un gran éxito para la manipulación de linajes nacidos en día embrionario E12.5 o 10 más tarde, 12-14. En electroporaciones útero antes de E12.5 no han tenido éxito debido principalmente a la letalidad asociada con la punción de la roofplate cuarto ventrículo, un paso necesario en la entrega de ADN exógeno que se electroporated en el LIF. Sin embargo, muchos linajes LRL derivados se derivan de la LIF anterior a E12.5 9. Estos linajes nacidos a principios incluyen las neuronas que componen el reticular lateral, cuneadas externa, y los núcleos olivar inferior del sistema precerebellar que funcionan para conectar las entradas de la médula espinal y la corteza del cerebelo, 5. Con el fin de manipular la expresión en el LIFde embriones de menos de E12.5, hemos desarrollado un sistema in vitro en el que los embriones se colocan en la cultura después de la electroporación.
Este estudio presenta un método eficiente y eficaz para la manipulación de la expresión de los genes de los progenitores LRL en E11.5. Los embriones electroporadas con la proteína verde fluorescente (GFP), impulsado por el promotor CAG ampliamente activa reproducible expresó GFP después de 24 horas de cultivo. Un aspecto crítico de este ensayo es que la expresión de genes sólo se altera debido a la expresión del gen exógeno y no debido a los efectos secundarios que resultan de la electroporación y técnicas de cultivo. Se determinó que los patrones de expresión de genes endógenos permanecen inalteradas en los embriones electroporated y culta. Este ensayo puede ser utilizado para alterar el destino de las células que surgen de la LIF de embriones menores de E12.5 mediante la introducción de plásmidos para la sobreexpresión o tumbar (a través de ARNi) de diferente pro-factores de transcripción neuronales.
Protocol
Discussion
La técnica de electroporación in vitro presentados en este estudio es una nueva metodología que puede ser utilizada de manera eficiente para manipular la expresión génica en embriones de menos de 12 días de gestación. La colocación de los embriones en cultivo permite la expresión del gen introducido y evita la letalidad observada cuando los embriones electroporadas se les permite permanecer en vivo. Esta técnica permite la manipulación de la expresión génica en células progenitor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Jane Johnson para el Math1, Ngn1, y los anticuerpos Ptf1a y Connie Cepko para el pCAG :: GFP plásmido. Este trabajo fue financiado por el NIH R15 1R15HD059922-01.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Cryostat | Leica | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Scientific Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Scientific Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher | AC41053-0250 | 0.01% |
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