非接触，无标签使用拉曼光谱研究细胞和细胞外基质的监测

1。生物样品的制备活细胞的制备贴壁细胞的制备种子在体外培养或新鲜分离的细胞上的玻璃底菜（格雷纳BioOne /德国），并于37°C和5％的CO 2细胞附着，直到完成。 去除培养基，轻轻洗脸用PBS事先测量三次。保持与PBS或细胞培养液覆盖在整个测量过程中的细胞。 悬浮细胞的制备根据共同协议（如胰蛋白酶EDTA，细胞刮） 在体外培养细胞的分离，离心细胞，并重新挂起得到细胞沉淀，PBS或细胞培养液中。 细胞悬液100μL（浓度：最大10万个细胞/毫升）转移到玻璃底菜。 准备的NAT香港专业教育学院组织收获后的组织，他们转移到无菌，冰冷的PBS不再让他们在4°C或上冰前测量超过12小时。以前的实验表明，延长贮存时间（冷缺血时间> 12小时在4°C）由于自然降解过程的光谱变化。 PBS或中等覆盖，以避免由于组织干燥ECM蛋白和细胞的损害组织必须执行测量。 2。拉曼光谱仪我们定制的拉曼光谱仪结合的拉曼光谱仪，使亮场的拉曼光谱和荧光图像直接比较标准的荧光显微镜（奥林巴斯IX 71）。基本设置包括1 784 nm的激光二极管（TOPTICA光电公司/德国），陷波滤波器的拉曼散射光激发光分离，在显微镜ND A摄谱仪，电荷藕合器件（CCD相机）优化光谱信息检测（软成像系统/德国的F-查看）（凯泽光学系统公司，安阿伯/美国）。 3。控制功能的激光启动软件索利斯安道尔（安道尔/英国）和CCD相机设置温度-60°C至最大限度地减少相机的热感应电流所造成的噪音。 校准过程硅片放置在显微镜阶段。 关闭激光和设置功率85兆瓦。 使用的软件单元B（奥林巴斯/德国）聚焦到晶圆的激光，直到出现的XY。 以1秒的单一集成使用一个60X空中目标的时间测量硅片。 改变从像素数安道尔索利斯软件的拉曼位移（厘米-1）x轴的单位。 因在520厘米-1硅峰激光聚焦收集的频谱，以便找到这拉曼光谱的强度最大。计数的最低金额必须超过11,000高，有一个成功的校准。 4。拉曼光谱测量所有测量均在室温下进行。 基本设置使用数值孔径为1.2 1 60倍水浸泡目标（奥林巴斯/德国），收集样本的频谱。 改变收购设置集成/ 10秒10，共100秒，每测量。 贴壁细胞的测量采取与细胞玻璃底菜，放在显微镜舞台上。 为了获得更好的信号，并确保可重复性，集中在细胞核的激光，把显微镜的光，并开始收集的频谱。 衡量一个背景e的参考谱非常10光谱通过旁边的细胞移动激光焦点。重要的是要考虑改变焦点时，一个新的背景下，必须为每个重点深入收集。 细胞悬浮液中的测量 100μL细胞悬液转移到玻璃底菜放在显微镜舞台上。 集中于细胞中心的激光，把显微镜的光，并开始收集的频谱。 通过旁边的细胞移动激光聚焦的背景参考谱每10光谱测量。当改变焦点，一个新的背景下，必须收集新焦点深度。 本地组织的测量采取样本，并放入一个玻璃底部菜。面临底部的菜，应该是面向感兴趣区域（ROI）的。 有足够的PBS填充盘覆盖样品。 样品置于玻璃盖，以避免任何MOV在测量过程中样品ement。 激光聚焦到利益格局的设置（深度分辨率是激光和组织依赖），并开始收集的光谱。 收集整个组织区移动激光聚焦的背景参考谱每10光谱。当改变焦点，一个新的背景下，必须收集新焦点深度。 免疫荧光（IF）的测量标记的冰冻切片节新鲜，冷冻单元的组织样本，使用标准cryotom和二氧化硅涂层的盖玻片上安装。 染色后，从业人员只有很短的固定步骤（最多10分钟，4％多聚甲醛）和使用适当的检测感兴趣的蛋白质抗体的常规协议的冰冻切片。 执行拉曼光谱测量，荧光发生在该地区为重点。 弹性蛋白降解实验解放军CE ventricularis的解剖猪主动脉瓣叶面临着底部的玻璃底菜（富弹性，血液流入心脏瓣叶层侧）。 作为“非孵化控制”，在整个组织表面的纤维状结构为重点的30个随机点测量的本地组织。 分为3个部分样品放入他们单独充满弹性蛋白酶溶液（5 U / ml的，沃辛顿/德国）2毫升2.5毫升的Eppendorf管。 孵育15或30分钟的组织，在37°C。 潜伏期为15或30分钟后，取出从Eppendorf管组织，并仔细用PBS冲洗，以完全停止酶反应。 测量每个样品在30个随机点，重点在纤维状结构。 5。数据处理和分析拉曼光谱处理治疗前的产生的光谱进行的OPUS软件（布鲁克OPTIK公司/德国）。 为了减少玻璃和中等以及干扰信号，以避免在测量过程中重点的变化引起的变化，从收集到的光谱减去相应的背景光谱。 减少光谱波数区域之间400-1800厘米-1，它提供的信息的最高金额。 如果需要的话，正常化的光谱的最大峰值。出的强度波动和系统故障，简化了检测样品的光谱中的结构性变化，正常化的因素。 执行基线校正，以增加不同的实验之间的可比性。 拉曼光谱的分析使用PCA与理瓶机软件（迷彩/挪威），拉曼光谱进行了分析。这多元的分析检测范围内的光谱数据的异同套。每收集计数每拉曼位移为基础的多维空间中的单点谱绘制。每个主成分（PC）的描述一定数量的原始数据中的总信息。第一台PC是一个包含最高的变异来源。每个下面的PC，以包含，低于前一个信息。每个变量有每一台PC上的得分和装载。通过绘制电脑（=分数），可以接触重要的样本相关。负荷描述每个PCA的分析变量的贡献。 标记每个组通过创建每个样本组连续范围的测量。 使用PCA的下列基本设置：NIPALS算法，交叉验证，无旋转，并开始分析。这些设置是光谱依赖。 执行的PCA。 6。代表结果拉曼SP贴壁细胞产生ectra往往揭示了低信号噪声比和较低的整体信号强度（ 图1）。激光焦点附近的玻璃底，干扰的影响的事实，由于11玻璃信号是相当高，造成实际的采样信号屏蔽。因此，采样信号可能会被最小化甚至消除在随后的背景减法。因此，我们倾向于使用悬浮细胞拉曼光谱的分析，因为它们允许更详细的光谱信息检测。然而，贴壁和悬浮细胞的光谱表现出相同的只有在不同强度的主峰。 对于不同类型的细胞内悬挂的特性，没有预先处理是必需的。平均拉曼光谱和人成纤维细胞，间充质干细胞（MSCs），软骨细胞和角质细胞的悬浮液中测量的标准偏差图2描绘。所有拉曼光谱类似的结构，峰从典型的生物分子，如蛋白质，核酸和脂类（ 见表1）12。对于这些类型的细胞，谱区之间的600和1800厘米-1包含最相关的光谱信息，其中明显的差异可检测到不同类型的细胞（ 图2A）之间。模范，我们强调一个谱区（1280年至1350年厘米-1）显示明显的结构性差异，这是分配的胶原蛋白和脂类分子振动。相比之下，形态分析是不适合大多数细胞的识别和区分（ 图2B-Ⅰ）。虽然软骨细胞和皮肤细胞之间的差异是可观的（ 图2D，H对B，F和E，我 ），成纤维细胞和骨髓间充质干细胞是难以分开使用纯粹明亮的领域micrsocopy（ 图2B，相比，F，C，G）13。 本地组织，特别是对ECM蛋白，拉曼光谱分析的要求，投资回报率可以由明场成像的可视化，以便能够专注于各自的结构。对于一个特定的指纹图谱蛋白质的分配，我们产生了市售的纯蛋白质和immunohistologically染色冰冻切片的拉曼光谱。在这里，我们确定了指纹图谱的比较冻干弹性和免疫荧光染色冰冻切片，采用对弹性蛋白的抗体，在本地组织的弹性纤维。然而，由于弹性具有很高的自体荧光，这是反映在拉曼光谱，数据分析是具有挑战性（ 图3A）。由于特定的属性，如自体荧光，适当的处理的数据集的样本，以减少系统的故障是至关重要的。在我们的数据alyses，我们使用正常化消除纯弹性蛋白的显着更高的信号强度，因此，我们能够产生类似的拉曼光谱（ 图3B）。弹性是一个最稳定的ECM蛋白在体内，因此很难降解。在我们的实验设置14，我们诱导健康的猪主动脉瓣叶弹性退化执行酶解。运用多元分析，我们确定了拉曼光谱的酶处理样品和本地控制（ 图3C）之间的显着性差异。这些光谱差异，观察在861，1003和1664 cm -1处的载荷谱。预期中含有弹性蛋白纤维由于曝光时间延长到弹性蛋白酶的结构性变化显示哈特的染色（ 图4），这也反映在更独特的可分离得分集群（ 图3C）。 图1。平均拉曼光谱分离和贴壁的成纤维细胞。 图2（a）平均拉曼光谱和4个不同的主隔离类型的细胞（成纤维细胞，间充质干细胞，软骨细胞和角质）的标准偏差。框架强调谱区1280 – 1350厘米-1的结构性差异。 （BE）明场图像的分离（二）成纤维细胞（C），骨髓间充质干细胞（D）软骨细胞和（五）角质。比例尺等于20微米。 （FI）的明场图像壁（女），成纤维细胞，（G）的骨髓间充质干细胞，（高）的软骨细胞和（我）角质。比例尺等于200微米。 （一）未经lyophili正常化的拉曼光谱图3。ZED弹性（蓝线），免疫荧光（IF）标记的冰冻切片（橙色线）和本地主动脉瓣叶内测量的弹性纤维（红线）。高的冻干弹性的信号强度是造成自体荧光。 （二）拉曼光谱正常化后，为了消除系统故障。 （三）成绩和负荷之间的非治疗对照组（红色）和酶降解（蓝色和绿色）在本地组织的弹性纤维比较。 图4。HART's染猪主动脉瓣叶。弹性纤维，是黑色的可视化。 （A）和（二）非治疗控制和（C）及（D）描绘组织样品暴露30分钟的弹性蛋白降解酶，弹性蛋白酶。 在厘米-1波数 </strong> 转让12 717-719 点数磷脂 785-788 DNA / RNA的基地， OPO的骨干 DNA / RNA的 1003 – 1005 苯丙氨酸蛋白质 1220至1280年酰胺三蛋白质 1445年至1447年通道2 蛋白质/油脂 1655年至1680年酰胺的IC = C的蛋白脂质 表1。拉曼带内的所有类型的细胞（成纤维细胞，间充质干细胞，软骨细胞和角质）光谱检测。