Farelerde Video-oculography

1. Hazırlık Aşağıdaki deney Hayvan Deneyleri için Duch Etik Kurul uygun olarak yapılmıştır. Video oculography farelere hazırlanması. Bir fare göz hareketleri ölçmek için, fare kafası immobilize edilmesi gerekmektedir. Bu nedenle, bir kaide yapım fare kafatası (Şekil 1) üzerinde yapılmıştır. Ve bir gaz odası içindeki oksijen; bir karışımı izofluran (Rhodia Organique Fine Ltd, Fransa İsofluran% 1-1.5) tarafından fare uyuşturmak. Aşırı gaz atma edilir. Burun konisi ile anestezi koruyun. Bir ayak tutam ile anestezi derinliği onaylayın. Bir anal thermosensor kullanımı ve bir ısıtma pedi (FHC, Bowdoinham, ME) ile 37 ° C de vücut ısısını korumak. Bir göz merhemi (duratears, Alcon, Belçika) ile kaplayarak gözleri koruyun. Dorsal kranial kürk Tıraş ve bodur ve betadin bir rotasyon ile cerrahi alanı temizlemeke veya klorheksidin çözüm. Kafatasının dorsal kranial yüzey için, bir orta çizgi kesi olun. Yüzey temiz ve kuru olun. Bregmadan lambda kafatasının dorsal kranial yüzeyine; fosforik asit (Kerr, CA fosforik asit jel asitlenmesi% 37.5) bir damla uygulayın. 15 saniye sonra asitlenmesi çıkarın ve kranial yüzey yeniden tuzlu ve kuru temizleme yapın. Bu kazınmış kranial yüzey Optibond'un başbakanı damla (Kerr, CA) ve 30 saniye süreyle hava-kuru üstüne uygulayın. Optibond'un başbakan üstüne Optibond'un yapıştırıcı (Kerr, CA) bir damla koyun ve 1 dakika (Maxima 480 görünür ışık kavurma ünitesi; Henry Schein, ABD) ışık ile tedavi. Charisma kompozit (Heraeus Kulzer, Almanya) ince bir tabaka ile yapışkan tabaka kaplayın. Kompozit: İki bağlı fındık (3 mm çapında) Embed. Işık ile kompozit sonra Cure. Gerektiğinde, kompozit ilave kat uygulayın ve ışık ile onları tedavi. Ilanpost-operatif analjezi bakanı buprenorfin (0.015 mg / kg, sc). Hayvan yaklaşık 5 dakika içinde kendi ayakları üzerinde tekrar edilmelidir. Fare cerrahisinden sonra, en azından 3 gün için oda sıcaklığında ev kafesinde kurtarmak için olanak sağlar. Fareler için video-oculography kurulumu (Şekil 2). Restrainer içinde fare yerleştirin ve iki vidayı (Şekil 1) restrainer başını düzeltmek. Fare bu işlem için narkoz gerekmez. Restraining süresi 1 saat / gün geçmemelidir. Buna karşılık döner tabla (: 60 cm çaplı) üzerine monte edilmiş bir XY platform üzerinde fare baş ve vücut restrainer, monte edilir. XY platformu kullanarak fare kafası pikap merkezinin üzerinde yerleştirilebilir. Fare pitch, yaw ve roll eksenler üzerinde hareket ettirilebilir. Fare kafası İŞCAN syste tarafından üretilen göz görsel görüntüsünü kullanarak göz hizalayarak doğru pitch, yaw ve roll açısı yerleştirilirm. Alternatif olarak, kaidenin yapım bir stereotaksik çerçevesi 11 fare başına yerleştirilebilir. Pikap bir servo kontrollü motor (Harmonik sürücü AG, Hollanda) ve pikap pozisyonuna bağlı pikap eksenine bağlı bir potansiyometre (Bourns inc., CA) tarafından izlenir. Bir silindirik çevreleyen ekran (çap: 63 cm, yüksekliği: 35 cm) rastgele bir noktalı desen (her elemanın 2 °) ile pikap kapsar; Bu davulun aynı zamanda bir AC servo kontrollü motor (Harmonik sürücüsü AG, Hollanda) ile donatılmıştır . Silindirik ekran konumu kendi ekseni ve ekran bir halojen ışık (20 Watt) ile aydınlatılmış olabilir bağlı bir potansiyometre (Bourns inc., CA) tarafından izlenir. Çevreleyen ekran ve pikap iki bağımsız tahrik edilmektedir. Pikap ve çevresindeki ekranın hareketi bir I / O arabirimini (CED sınırlı, Cambridge, İngiltere) bağlı bir bilgisayar tarafından kontrol edilir. Ta, I / O arayüzü ile sayısallaştırılmış ve bu bilgisayarda depolanan: ble ve çevresindeki ekran konumu sinyalleri (20 Hz cut-off frekans) filtrelenir. Farenin gözü üç kızılötesi yayıcılar ile aydınlanıyor (600 mW, dağılma açısı: 7 °, tepe dalga boyu: 880 nm, RS bileşenleri, Hollanda). İki kızılötesi yayıcılar döner sabitlenir ve üçüncü bir emiter makinesi eklenir. Bu üçüncü verici kalibrasyon prosedürü sırasında ve göz hareketi kayıtları sırasında kullanılan bir referans kornea yansıması (CR), üretir. Bir zoom lens (Zoom 6000, Navitar inc., NY) ile donatılmış bir kızılötesi CCD kamera pikap takılır ve pikap merkezinde fare kafası odaklanmıştır. Kamera kalibrasyon işlemi sırasında tam 20 ° üzerinde kilidi olabilir ve pikap ekseni etrafında yawed edilebilir. Video sinyali bir göz takip sistemi (İŞCAN ETL-200, Burlington, MA) tarafından işlenir. İŞCAN sistemi algoritması kullanıröğrenci ve referans CR merkezleri izlemek için bir model geliştirilmiştir. Sistem 120 Hz örnekleme hızı yatay ve dikey yönde öğrenci ve referans CR izleyebilirsiniz. Referans CR konumu, gözbebeği konumunda ve gözbebeği boyutuna sinyalleri I / O arayüzü ile sayısallaştırılmış ve tablo ve çevresindeki ekran konumu sinyalleriyle aynı dosyada saklanır. Video öğrenci takip sistemi yaklaşık 27 ms göz hareketi sinyalleri bir gecikme neden olur. 2. Öğrenci-video izleme kullanma Göz Hareketleri Kalibre ve Ölçme Göz izleme sistemi bir ötelenme hareketi olarak öğrenci hareketi yakalar. Izlenen öğrencinin ötelenme hareketi göz dönme merkezi ve göz (kornea eğriliğinin yani merkezi) anatomik merkezi ve göz küresinin açısal rotasyon nedeniyle bir dönme bileşeni arasındaki eksenel farkı nedeniyle öteleme bileşeni içermektedir. Subtract tarafındanöğrenci hareketi / pozisyondan referans CR ing, istenmeyen translasyonel bileşeni yalnızca gözün rotasyon nedeniyle bir ötelenme hareketi sonucu, sinyal elimine edilir. Genellikle çok küçük olmasına rağmen, bu çıkarma da baş ve kamera arasında çevirileri ortadan kaldırır. Kalıntı izole ötelenme hareketi aşağıdaki kalibrasyon yöntemi 8,12 tarafından gözün açısal dönüş dönüştürülür. Bu kalibrasyon herhangi bir göz hareketi deney öncesinde yapıldı. Öğrencinin video görüntüsü monitörün ortasında yer alan ve referans CR temsil tercihen doğrudan öğrencinin yukarıda göz dikey orta hat üzerinde yer aldığını, bu gibi bir şekilde kameraya fare baş pozisyonu ayarlayın. Nedeniyle kamera / tablo ekseni üzerinde kornea eğrilik merkezi yerleştirilmesiyle gerçekleştirilebilir açısal makinesi rotasyonlar, referans CR hareketleri en aza indirir. </ Li> 10 ° (yani 20 derece tepeden tepeye) pikap dikey ekseni etrafında + / – ile kamera birkaç kez döndürün. (Öğrenci dönme yarıçapı hesaplamak için makinesi dönme uç konum kaydedilmiş paletli pupil (P) ve referans CR pozisyonları kullanmak Rp, Rp = Δ / sin (20 °); Δ = (CR -P)) Şekil 3A bkz. Rp değeri gözbebeği boyutuna bağlıdır olması nedeniyle, bir öğrenci boyutu düzeltme 12 (Şekil 3B) uygulanması gerekmektedir. Rp ilişki ve bir Rp düzeltme eğrisi (Şekil 3D) compose – öğrenci boyutunu belirlemek amacıyla; (Şekil 3C yani gözbebeği boyutu manipüle) çeşitli aydınlatma koşullarında 2.2 birçok kez yineleyin. Rp değeri ayrıca dikey göz konumuna bağlıdır. Deney dikey göz hareketlerinin neden olacak zaman sonra dikey göz pozisyonlar için kalibrasyon bir düzeltme yüksek tavsiye edilir13. Referans CR pozisyonu, P konum ve boyut ölçümü ile pupil gözün (E) açısal pozisyonunu belirlemek. Referans CR konumu öteleme ücretsiz gözbebeği konumunda üreten gözbebeği konumunda çıkarılır. Pupilla büyüklüğü ölçülerek Rp değeri Rp düzeltme eğrisi elde edilebilir ve E aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanabilir E arcsin = {(Δ1) / Rp} (Şekil 4A; nerede Δ1 = (P 2 P-1) ve P 1 ve P 2) referans CR çıkarılması ile düzeltilir. Döner tabla ve / veya çevre ekranı rotasyonlar büyük bir repertuarı artık okülomotor sistemi uyarmak için kullanılabilir. Koyu video oculography gerçekleştirmek için, fare göz dilatasyon sınırlamak ve bu koşullar altında pupil izlenmesine izin bir miyotik ilaç ile ön tedavi edilmesi gerekmektedir. Deneylerde, biz pilokarpin (% 4, Laboratuarlar Chauvin, Fransa) dilatasyon sınırlamak için kullanabileceğinizkaranlık. 3. Veri Analizi Göz pozisyonları, masa pozisyonları ve çevresindeki ekran konumu, (2.4 Şekil 4B ve formül bakınız) açısal konumlar dönüştürülür. Göz sinyalleri öğrenci izleme sisteminin görüntü işleme göre 27 ms indüklenen onların gecikme için düzeltilmiştir. Göz, masa ve çevresindeki ekranın Açısal pozisyonları farklılaşmış ve 20 Hz frekanslı kapalı bir kesim kullanarak Butterworth alçak geçiren filtre ile filtrelenir. Sakkadlar 40 ° / s değerinde bir algılama eşik kullanılarak göz hızı sinyali kaldırılır. Veri algılama eşiği geçtikten sonra 20 ms için 80 ms önce ve yukarı başlayarak kaldırılır. Tablo, çevredeki ekran ve göz hız sinyalleri parkuru (Şekil 4C) her çevrimi kullanılarak ortalaması alınır. Ortalamalı sinyalleri uygun bir fonksiyon ile donatılmıştır. Genel olarak, bir sinüsoidal hızı uyarı kullanılan ve ortalaması alınırdöngüleri sinüs veya cosinus fonksiyonu (Şekil 4C) ile donatılmıştır. Aşaması göz hızı ve uyaranın hızı arasındaki fark (derece) olarak hesaplanabilir oysa Sonra, kazanç, uyaran hızı göz hızı oranı olarak hesaplanabilir. 4. Temsilcisi Sonuçlar Yanı sıra, motor öğrenme (VOR adaptasyonu; okr adaptasyon) Video-oculography çeşitli okülomotor performansları formları (:;:; VOR görsel açıdan geliştirilmiş vestibülookuler refleks VVOR vestibülookuler refleks okr yani optokinetik refleks) araştırmak için kullanılabilir. Okr görsel geribildirim kullanılarak düşük frekans bozuklukları telafi eder. Okr iyi aydınlatılmış çevreleyen ekran (Film 1) çevirerek bağlı olabilir. 1.6 derecelik bir genlik ile 0.2 -1.0 Hz frekans aralığında çevreleyen ekran döndürme optokinetik sistemi düşük frekans aralığı tha daha verimli bir telafi mekanizması nasıl gösterirn, yüksek frekans aralığında (Şekil 5A). VOR vestibüler organları gelen sinyalleri kullanarak yüksek frekanslı baş hareketlerini telafi eder. VOR (Movie 2) karanlıkta hayvan (yani pikap) çevirerek bağlı olabilir. 1.6 derecelik bir genlik ile 0.2 -1.0 Hz frekans aralığında pikap Döner (Şekil 5A) vestibülookuler sistemi düşük frekans aralığında daha yüksek frekans aralığında telafi göz hareketleri üreten de daha verimli nasıl gösterir . Konserde optokinetik ve vestibülookuler sistemi hareket, görüntü kafa hareketleri geniş bir aralıkta retina üzerine stabilize edilebilir zaman. Çevreleyen ekranı iyi aydınlatılmış iken, 1.6 ° 'lik bir genlik ile 0.2 -1.0 Hz frekans aralığında pikap Döner (Movie 3) göz tüm frekans aralığı içinde "yüksek kazanç" telafi edici hareketleri (Şekil 5A üretir nasıl gösterir ). Tüm bu artışı ve pHcinsiyet 14 ve zorlanma 15,16,17 farklılıklar rapor edilmiştir ancak ase değerleri, fareler için tipiktir. Pikap ve çevresindeki ekran üzerinde bağımsız kontrol bize görsel ve vestibüler bilgi arasında bir uyumsuzluk ile farelere karşı karşıya sağlar. Uyumsuz görsel ve vestibüler bilgi uzun vadeli ve düzgün maruz kaldıktan sonra, farenin VOR değişmiş görsel girdi (; Film 4 VOR adaptasyon) telafi etmek için değişecektir. Çevredeki ekran (1 Hz, 1.6 °) ile (yani 180 °) faz pikap dışarı Döner VOR kazanç (Şekil 5B) artırır. VOR kazancı maksimum değişim, bir deneme öğrenme paradigması kullanırken, genellikle 30 dakika sonra ulaşılır. Şekil 1. Fare baş ve vücut restrainer şematik çizimi. Farenin gövdesi kullanılarak kısıtlanır35 mm'lik bir çapa sahip bir plastik silindirik tüp. Fare kafası iki vida ile demir çubuğuna fare kaide bağlanarak immobilize edilir. Demir çubuk yürüme sırasında normal pitch farenin kafasının bulunduğu için, 30 derecelik bir açı yapar. * Iki fındık içeren kaidenin üst görünümü. Şekil 2. Fare video oculography kurulum şematik çizimi. Şekil 3. Video öğrenci izleme sisteminin kalibrasyon. 10 ° (yani zirveye 20 derecelik tepe) pikap dikey eksen etrafında – A) kamera + / döndürülebilir birkaç kez. Paletli pupil (P) ve makinesi dönme uç konum kaydedilmiş referans yansıma kornea (CR) pupil dönme yarıçapı hesaplamak için kullanılmıştır(Rp). B) pupil çapının yarıçapı pupillanın büyüklüğüne bağlıdır. C) Örnek (iki piksel (piksel cinsinden)) Kalibrasyon işlemi sırasında öğrenci pozisyonuna pupilla büyüklüğünün etkisini gösteren. D) Rp ve pupil çapı arasındaki ilişki tek bir fare cinsinden ölçülür. On üç farklı pupil çapı çevredeki ışığın yoğunluğunu değiştirerek tarafından gerçekleştirilmiştir. Şekil 4. Ölçme ve video öğrenci-izleme ile göz hareketlerini analiz. CR pozisyon için düzeltilmiş); A) açısal gözbebeği konumunda öğrenci yarıçapı (Rp) ve Öğrenci pozisyonu (P hesaplanır. B) telafi edici göz hareketi örneği vestibüler ve görsel sistemi (görsel gelişmiş VOR) uyararak indüklenen. Çevreleyen ekranı iyi aydınlatılmış iken pikap, 1.6 ° 'lik bir genlik ile 0.6 Hz'de döndürülmüş sinüsoidal oldu. C) kayıt Analizleri) B işleminde gösterildiği gibi. Grafik turntable (mavi) ve öğrenci (kırmızı) ortalama hız iz gösterir. Bu ortalama izleri sinüzoidal bir fonksiyonu (siyah) ile donatılmıştı. Şekil 5. Performans ve bir C57Bl6 fare ölçülen okülomotor sistemi öğrenme. (Vestibülookuler refleks karanlıkta fare döndürerek, okr, üst paneller): VOR, orta paneller) ve (görsel ışık fare döndürerek A) Göz hareketleri çevredeki ekran döndürme (optokinetik refleks tarafından oluşturulur artırılmış vestibülookuler refleks: 0.2 1.6 ° 'lik bir genlik az 1.0 Hz arasında değişen frekansları ile VVOR, alt panel). Refleksinin kazancı uyaran hızına göz hızı oranı (sol paneller) ve refleksinin faz olarak hesaplanmıştır göz hızı ve uyaran hızı (sağ paneller) arasındaki faz farkı ile hesaplanmıştır. B) Motor öğrenme ile gerçekleştirilmiştir bağdaşık aşamalı eğitim paradigmasının dışında bir kullanarak VOR artmaktadır. Fare fare rotasyon kırk dakika boyunca çevredeki ekran (1.0 Hz, 1.6 ° dönen iki) bu rotasyon ile faz (180 °) dışındaydı hangi bir visuovestibular eğitim paradigma tabi oldu. Her 10 dakikalık VOR (1.0 Hz, 1.6 °) test edilmiştir. Bu fare faz eğitim dışarı VOR kazancı arttı. Film 1. Farelerde okr neden paradigma gösteren animasyon filmi görmek için buraya tıklayın . Film 2. Farelerde VOR neden paradigma gösteren animasyon. filmi görmek için buraya tıklayın . Farelerde VVOR neden paradigma gösteren Movie 3. Animasyon..com/files/ftp_upload/3971/3971movie3.mov "target =" _blank "> filmi görmek için buraya tıklayın. Film 4. Farelerde VOR adaptasyon (artış) neden aşamalı eğitim paradigmasının visuovestibular dışarı gösteren animasyon. filmi görmek için buraya tıklayın .