Agarosegelelektroforese voor de scheiding van DNA fragmenten
Summary
Een basisprotocol voor het scheiden van DNA-fragmenten met agarose gel elektroforese beschreven.
Abstract
Agarosegelelektroforese de meest effectieve manier te scheiden DNA fragmenten van variërende grootte van 100 bp tot 25 kb 1. Agarose is geïsoleerd van het zeewier geslachten Gelidium en Gracilaria, en bestaat uit herhaalde agarobiose (L-en D-galactose) subeenheden 2. Tijdens gelering, agarose polymeren niet-covalent geassocieerd en een netwerk vormen bundels die poriegrootten bepalen van een gel moleculaire zeven eigenschappen. Het gebruik van agarose gel elektroforese revolutie de scheiding van DNA. Voorafgaand aan de vaststelling van agarose gels, werd DNA in de eerste plaats gescheiden met behulp van sucrose dichtheidsgradiënt centrifugeren, die alleen voorzien in een aanpassing van de grootte. DNA met agarose gel elektroforese scheiden, wordt het DNA geladen prefab putjes in de gel en een stroom toegepast. De fosfaat ruggengraat van het DNA (en RNA) molecuul negatief geladen derhalve, wanneer geplaatst in een elektrisch veld wordt DNA fragmenten migreren naar de positively geladen anode. Omdat DNA heeft een massa / ladingsverhouding worden DNA-moleculen gescheiden op grootte op een agarose gel in een zodanig patroon dat de afstand afgelegd omgekeerd evenredig met de log van het molecuulgewicht 3. De belangrijkste model DNA bewegen door een agarose gel wordt "voorgespannen reptation", waarbij de voorrand voren beweegt en trekt de rest van het molecuul aan 4. De snelheid van migratie van een DNA molecule via een gel wordt bepaald door de volgende: 1) maat van DNA-molecuul; 2) agarose concentratie 3) DNA conformatie 5, 4) toegepaste voltage, 5) de aanwezigheid van ethidiumbromide, 6) type agarose en 7) elektroforese buffer. Na de scheiding kan het DNA moleculen zichtbaar onder UV-licht na kleuring met een geschikte kleurstof. Door het volgen van dit protocol, moet de student in staat zijn om:
- Begrijpen mechanisme waardoor DNA fragmenten worden gescheiden in een gelmatrix
- Begrijpen hoe conformatie van deDNA-molecuul zal zijn bepalend voor de mobiliteit door middel van een gel matrix
- Vaststellen van een agarose-oplossing van geschikte concentratie voor hun behoefte
- Bereid een agarose gel elektroforese van DNA
- Stel de gel elektroforese apparatuur en voeding
- Kies een geschikte spanning voor de scheiding van DNA-fragmenten
- Begrijp het mechanisme waarmee ethidiumbromide zorgt voor de visualisatie van DNA-banden
- Bepaal de grootte van DNA fragmenten gescheiden
Protocol
Discussion
Agarosegelelektroforese blijkt een efficiënte en effectieve manier te scheiden nucleïnezuren zijn. Hoge gel Agarose de kracht maakt de behandeling van lage percentage gels voor het scheiden van grote DNA-fragmenten. Moleculaire zeef wordt bepaald door de grootte van de poriën gegenereerd door de bundels agarose 7 in de gelmatrix. In het algemeen hoger de concentratie van agarose, hoe kleiner de poriëngrootte. Traditionele agarose gels meest effectief bij de scheiding van DNA-fragmenten van 100 bp tot 25 kb. DNA-fragmenten groter dan 25 kb scheiden, wordt een puls moeten gebied gelelektroforese 6, waarin de toepassing van wisselstroom uit twee verschillende richtingen omvat gebruiken. Op deze wijze grotere afmetingen DNA fragmenten worden gescheiden door de snelheid waarmee ze zich oriënteren van de veranderingen in stroomrichting. DNA-fragmenten kleiner dan 100 bp beter gescheiden door Polyacrylamide gel elektroforese. Andersagarose gels, wordt de polyacrylamidegel matrix gevormd door een vrijeradicaalmechanisme aangedreven chemische reactie. Deze dunnere gels zijn van hogere concentratie, zijn verticaal lopen en hebben een betere resolutie. In moderne DNA sequentiebepaling capillaire elektroforese wordt gebruikt, waarbij capillairen worden gevuld met een gelmatrix. Het gebruik van capillaire buizen voorziet in de toepassing van hoge spanningen, waardoor de scheiding van DNA-fragmenten (en de bepaling van de DNA-sequentie) snel.
Agarose kan worden aangepast aan laag smeltpunt agarose creëren door middel van hydroxyethylation. Laagsmeltende agarosegel wordt gewoonlijk gebruikt bij de isolatie van DNA-fragmenten gescheiden gewenst. Hydroxyethylation vermindert de dichtheid van de agarose bundels, effectieve vermindering van hun poriegrootte 8. Dit betekent dat een DNA fragment van dezelfde grootte langer duurt om door een laagsmeltende agarosegel in tegenstelling tot een standaard agarosegel. Omdat de bundels met elkaar koppelendoor niet-covalente interacties 9 is het mogelijk hersmelten een agarosegel na het uitharden.
EtBr is de meest voorkomende reagens DNA vlek in agarose gels 10. Bij blootstelling aan UV-licht, elektronen in de aromatische ring van ethidium molecuul geactiveerd, waardoor het vrijkomen van energie (licht) als elektronen terugkeer naar grondtoestand. EtBr werkt door te intercaleren zich in de DNA-molecuul in een concentratie-afhankelijke wijze. Dit maakt een schatting van de hoeveelheid DNA in een bepaalde DNA-band op de intensiteit. Door de positieve lading, het gebruik van EtBr vermindert de DNA migratie met 15%. EtBr is een verdacht mutageen en carcinogeen, daarom moet men voorzichtig met agarose gels waarin het voorkomt. Bovendien wordt EtBr als een gevaarlijke en worden afgevoerd. Alternatieve vlekken voor DNA in agarose gels zijn onder andere SYBR Goud, SYBR groen, Crystal Violet en Methyl Blue. HiervanMethyl Blue en kristalviolet niet nodig blootstelling van de gel met UV licht visualisatie van DNA-banden, waardoor de kans mutatie indien herstel van het DNA-fragment uit de gel wordt gewenst. Maar hun gevoeligheid lager dan EtBr. SYBR goud en SYBR groen zijn beide zeer gevoelig, uv afhankelijk van kleurstoffen met een lagere toxiciteit dan EtBr, maar ze zijn aanzienlijk duurder. Bovendien alle alternatieve kleurstoffen hetzij niet of niet goed werken als direct toegevoegd aan de gel, waardoor de gel moeten na gekleurde na elektroforese. Vanwege de kosten, gebruiksgemak, en gevoeligheid, EtBr blijft de kleurstof van de keuze voor vele onderzoekers. Echter, in bepaalde situaties, zoals bij het gevaarlijk afval is moeilijk of wanneer de jonge studenten een experiment uitvoeren, kan een minder giftige kleurstof de voorkeur.
Laden kleurstoffen in gelelektroforese dienen drie doeleinden. Eerst toe te voegen dichtheid om het monster, Waardoor het te zinken in de gel. Ten tweede, de kleur en kleurstoffen vereenvoudigen het laadproces. Ten slotte is de kleurstoffen verplaatsen standaardtarieven door de gel, waardoor de schatting van de afstand die DNA-fragmenten zijn gemigreerd.
De exacte maten van gescheiden DNA fragmenten kunnen worden bepaald door het uitzetten van de log van het molecuulgewicht van de verschillende banden van een DNA standaard tegen de afstand van elke band. De DNA-standaard bevat een mengsel van DNA-fragmenten van vooraf bepaalde afmetingen kunnen worden vergeleken met de onbekende monsters DNA. Het is belangrijk op te merken dat verschillende vormen van DNA door de gel te bewegen met verschillende snelheden. Plasmide DNA, vanwege de compacte bouw, zich door de gel snelste, gevolgd door een lineaire DNA fragment van dezelfde grootte, met de open cirkelvorm reizen de laagste.
Tenslotte, aangezien de toepassing van agarose gels in 1970 voor de scheiding van DNA, heeftbewezen als een van de meest bruikbare en veelzijdige technieken in de biologische wetenschappen onderzoek.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Boric acid | Sigma | B7901 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Ethidium bromide | Sigma | E7637 | Carcinogenic-needs to be disposed of as hazardous waste |
| Glacial acetic acid | Fisher | BP2401-212 | Corrosive |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
| Tris base | Sigma | T1503 | |
| Investigator/FX gel documentation system | Fotodyne | ||
| Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system | Thermo Scientific | B1-PTM | |
| EPS 301 power supply | GE Healthcare | 18-1130-01 |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning. , (2001).
- Kirkpatrick, F. H. Overview of agarose gel properties. Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R•EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).
- Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis. Science. 243, 203-206 (1989).
- Aaji, C., Borst, P. The gel electrophoresis of DNA. Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).
- Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. Pulsed field gel electrophoresis. Biotechniques. 7, 34-42 (1989).
- Devor, E. J. . IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).
- Serwer, P. Agarose gels: properties and use for electrophoresis. Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).
- Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans. J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).
- Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis. 生物化学. 12, 3055-3063 (1973).
