Isotachophoresis (ITP) toksini tanıma ve numune hazırlama kadar uygulamaları ile sağlam bir elektrokinetik ayırma ve zenginleştirme tekniktir. Ayırma ve küçük moleküller ve hücre kültürü lizatı nükleik asitlerin saflaştırılması tespiti: Biz ITP fiziksel prensipleri ve iki özel örnek uygulamalar için bu tekniği uygulayarak metodolojisi gözden geçirin.
Elektrokinetik teknikleri, çünkü hiçbir hareketli parça ile basit, kompakt sistemlerde akışkan ve elektroforetik süreçlerinin çeşitli gerçekleştirmek için kendi benzersiz yeteneği mikro uygulamaların bir elyaf bulunmaktadır. Isotachophoresis (ITP) iyonik mobilite göre milyon kat önderiştirme 1,2 ve verimli ayırma ve çıkarma ulaşabiliriz basit ve çok sağlam elektrokinetik tekniktir. Örneğin, ayırma ve etiketsiz hassas tespiti için ITP uygulama göstermiştir 3 çok az veya hiç Numune hazırlama 4-8 ile ve hücre kültürü, idrar, kan gibi karmaşık bir matris gelen nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için iyonik molekülleri (örn. toksinler, DNA, rRNA, miRNA). 9-12
ITP odaklanma ve akıcı bir kanal sistemi içinde uygulanan bir elektrik alanı ve iki Tampon kullanan ayrılması başarır. Anyonik analitler için, önde gelen elektrolit (LE) tampon s seçilironun anyonlar sondaki elektrolit (TE) tamponu (Etkili hareketliliği bir iyon gözlemlenebilir sürüklenme hızı olarak açıklanmaktadır ve Persat ve arkadaşları tarafından detaylı olarak tarif dikkate iyon iyonizasyon durumuna alır ve anyon daha yüksek etkili elektroforetik hareketlilik olduğu uch . 13). TE ve LE arasında bir arayüz kurduktan sonra, bir elektrik alanı LE iyonlar TE iyonları tarafından işgal edilmiş bölgeden uzaklaşmaya böyle uygulanır. Öncesinde TE iyonlarının ama ara etkili hareketlilik yarış Örnek iyonları LE iyonları sollamak edemez ve böylece LE-TE arayüzü (bundan sonra "ITP arayüzü" olarak adlandırılır) de odaklanmak. Ayrıca, TE ve ITP arayüzüne dik bir elektrik alanı degrade kurmak sırasıyla düşük ve yüksek iletkenlik, LE form bölgeleri. Onlar odak olarak bu alanda degrade örnek türler preconcentrates. Uygun olmayan diğer odaklı türlerden odaklanan ve hedef türlerin arıtma TE ve LE sonuçları seçimi ve en sonunda bir ayrılıkörnek türlerin d ayrımı.
Biz burada fiziksel ilkeleri esas ITP gözden geçirmek ve iki çalışma standart modlar tartışmak: "zirve" ve "yayla" modları. Pik modunda, nispeten örnek iyonlar ITP arayüzü dar doruklarına örtüşen içinde birlikte ele sulandırın. Plato modunda, daha bol örnek iyonları bir kararlı durum konsantrasyonuna ulaşmak ve onların etkin hareketlilik tarafından sipariş komşu plato gibi bölgeleri içine ayırınız. Tepe ve yayla modları aynı temel fizik doğan, ancak ilk analit konsantrasyonu ve / veya örnek birikimi için ayrılan süreyi göre farklı farklı rejimleri temsil eder.
Biz ilk ayrıntılı bir model pik modunda deneyde tanımlamak ve sonra E. nükleik asitlerin ekstraksiyonu için bir zirve modu tahlil göstermek coli hücre kültürü. Biz ayrımı görselleştirmek için olmayan bir odak tracer (NFT) türleri kullandığınız yere, bir plato modu test sunarak başına ve sonuçlandırmakAmino asitlerin kantitatif oluştururlar.
ITP yöntemleri burada iyonik moleküllerin hızlı, hassas ve sağlam algılama ve işleme olanak sundu. İTP kullanarak temel zorluk LE ve TE tamponlar uygun seçimdir. Bu, çok yüksek mutlak hareket yeteneğine sahip güçlü bir asittir ve böylece çok öngörülebilir özelliklere sahip olduğundan anyonik ITP olarak, tipik olarak gelen anyon olarak klorid tercih. Bu nedenle, anyonik ITP'de tampon seçimi, genellikle uygun bir TE ve kontriyon tercih indirgenir. Seçici odaklanma deneyler için, TE seçim iyonları kirletici dışlanması için çok önemlidir. Kirletici maddeler mevcut olmayan uygulamalar olarak, düşük bir TE etkili hareketliliği odaklama hızlı bir oranda yol açar. MES, MOPS, HEPES, trişin: Biz nispeten anyonik TE iyonları uslu, aşağıdaki kullanmanızı öneririz. Kontriyon Seçimi sistemi pH ve TE etkili bir hareketlilik hem de etkiler. Yaygın counterions tris (pKa 8.1) ve bis-tris (pKa 6.4) vardır. Düşük veya yüksek pH gerektiren testler için, piridin tavsiye (pKa 5.25) vesırasıyla, etanolamin (pKa 9.5),. Tablolar 1 ve 2'de, anyonik, katyonik ITP için, sırası ile, bir çok faydalı tampon örnekleri özetler. Bu katyonik LE iyonu olarak anyonik LE iyonu ve sodyum gibi HCl alır, ve bu LE tamponun 100 mM iyonik kuvvet varsayılmaktadır.
Okuyucunun protokolleri bu tampon iyonik gücün not edin (Tablolar 1-2 ve in) her zaman büyük veya 10 mM eşit olacaktır. Teoride ITP fizik 10 mM daha düşük iyonik gücü de geçerlidir, 1 mM düzeyine yakın doğal kirleticiler (su ve atmosferdeki karbondioksit arasındaki reaksiyonun örneğin karbonik asit) genellikle düşük iyonik güçlü tamponlar pratik kullanımını sınırlandırmaktadır.
Bu sinyal iletimi mekanizmasının Bu protokolde sunulan deneyleri ile sınırlı değildir, dikkat ediniz. Bölgeleri saflaştırılmış plato modunda Bölüm 5, kısaca değinildiği gibi yerel iletkenliği değişiklikler, UV absor yoluyla tespit edilebilirkırılma ağır bozukluklar, sıcaklık veya dizin. Kendi grubunda, biz bilinmeyen analitlerin hassas algılama ve tanımlama için floresan taşıyıcı ampholytes kullanan bir yöntem geliştirdik. Pik modunda deneylerde 5, spesifik problar odaklı analitler etiketlemek için kullanılabilir. Yüksek özgüllük ile hedef DNA veya RNA molekülleri tespit 11,18 – kendi hedef diziyle hibridizasyon üzerine floresan oligonükleotid problar – Bir örnek olarak, moleküler işaretleri kullanabilir.
ITP basınç tahrikli akışı ve EOF kaynaklanan dispersiyon için göreceli olarak sağlamdır iken, aşırı EOF ortalama EOF hızı ITP hızına eşit olur ITP arayüz, durgunluk yol açabilir. 14 gibi güçlü bir EOF özellikle yüksek pH şartlarında meydana ve düşük iyonik gücü. Bu nedenle, 100 mM amacıyla uygun olursa üzerindeki pH 8 veya daha düşük olan ve iyonik gücü olan tamponlar kullanılması tavsiye edilir. Deneyimlerimize göre, PVP olduğunuborosilikat fiş EOF bastırılması için en etkili kaplama. Ancak, bu eleme özellikleri, örneğin PVP genomik DNA odaklama gibi bazı uygulamalar için uygun olmayabilir. Deneylerde, PVP eklenmesinin büyük ölçüde (bunu ele vermez noktaya) genomik DNA mutlak hareketlilik azaltabilir dikkat. Bu durumda böyle bir yüzey (örneğin Triton-X 100) ile conjuction Sigmacote olarak silanolle kaplama da EOF azaltmada etkili olabilir. 10
TE anyon (pKa -1) | ||||
Tamponlama karşı iyon (pKa 1) | MES (6.10) | MOPS (7.20) | HEPES (7.50) | trişin (8.15) |
etanolamin (9.50) | 21.41 | 20.40 | 17.38 | 22.85 |
tris (8.08) | 21.00 | 19.23 </ Td> | 15.84 | 17.56 |
bis-tris (6,40) | 18.22 | 10.41 | 7.30 | 5.23 |
piridin (5.18) | 1.01 | 3.72 | 2.42 | 1.48 |
Tablo 1. LE 100 mM HCl ve 200 mM tamponlama karşı iyon anyonik İTP arındırılmış saf analit bölgesi Etkin hareketlilik büyüklüğü (× 10 -9 m 2 / V / s).
TE katyonu (pKa 1) | ||||
Tamponlama karşı iyon (pKa -1) | etanolamin (9.50) | tris (8.08) | bis-tris (6,40) | piridin (5.18) |
MES (6.10) | 35.57 | 21.96 | 16.39 | 10.45 |
MOPS (7.20) | 35.47 | 20.92 | 9.76 | 3.93 |
HEPES (7.50) | 35.35 | 19.97 | 7.77 | 2.88 |
Trişin (8.15) | 34.77 | 16.72 | 4.50 | 1.44 |
Tablo 2. Katyonik İTP düzeltilmiş saf analit bölgenin Etkili hareketlilik büyüklüğü (× 10 -9 m 2 / V / s) LE 100 mM sodyum ve 200 mM tampon karşı iyon.
The authors have nothing to disclose.
Biz minnetle DARPA sponsorluğunda Mikro / Nano Fluidics Temelleri Focus (MF3) sözleşme numarası N66001-10-1-4003, altında Merkezi'nden ve DARPA hibe N660001-09-C-2082 fon kabul ediyorsunuz.
REAGENTS | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Distilled water | GIBCO | 10977 | RNase/DNase free |
Clorox Ultra | Clorox | 02489CT | |
sodium hydroxide (NaOH) | Mallinckrodt | 7708 | |
hydrochloric acid (HCl) | EMD Chemicals | HX0603-4 | |
Trizma base (tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
polyvinylpyrrolidone (PVP) | Polysciences Inc. | 06067 | MW 1,000,000 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
Alexa Fluor 488 carboxylic acid | Invitrogen | A20000 | |
tricine | Sigma-Aldrich | T-9784 | |
bis-tris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
EDTA | GIBCO | AM9260G | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
SYBR Green II | Invitrogen | S7564 | |
ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000 | |
Rhodamine 6G | Acros Organics (Geel, Belgium) | CAS 989-38-8 | |
L-Amino Acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4389986 | |
PCR primers | Integrated DNA Technologies | ||
EQUIPMENT | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Borosilicate microfluidic chip | Caliper Life Sciences Inc. | NS12A | Supplied with or without plastic caddy |
Vacuum pump | Gast | DOA-P104-AA | |
Sourcemeter | Keithley | 2410 | Constant current and constant voltage operation modes |
Inverted epifluorescent microscope | Olympus | IX70 | Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination |
Filter cube | Omega | XF115-2 | Excitation/emission: blue/green |
Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 022363204 | 1.5 mL capacity |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C |
Table 3. Specific reagents and equipment.