Isotachophoresis (ITP) היא הפרדה electrokinetic חזקים בטכניקה preconcentration עם יישומים החל איתור הרעלן הכנת המדגם. אנו בודקים את עקרונות פיסיקליים של ITP ו המתודולוגיה של יישום טכניקה זו שני יישומים דוגמה ספציפית: הפרדה וזיהוי של מולקולות קטנות וטיהור של חומצות גרעין מ lysate תרבית תאים.
טכניקות Electrokinetic הם מרכיב עיקרי של יישומים microscale בגלל היכולת הייחודית לבצע מגוון של תהליכים fluidic ו electrophoretic ב, מערכות קומפקטיות פשוטות ללא חלקים נעים. Isotachophoresis (ITP) היא טכניקה electrokinetic פשוט מאוד חזקים שיכולים להשיג הפרדה של פי 1,2 מיליון preconcentration ויעיל והפקת המבוסס על ניידות יוניים. 3 לדוגמה, אנו הוכיחו את היישום של ITP להפרדה וזיהוי רגיש ללא תווית מולקולות יוניים (רעלים כגון DNA, rRNA, מירנה) עם מעט או ללא הכנה מדגם 4-8 ו מיצוי וטיהור של חומצות גרעין של מטריצות מורכבות כולל תרבית תאים, שתן ודם. 9-12
ITP משיגה מיקוד ההפרדה באמצעות שדה חשמלי היישומי שני מאגרים במערכת ערוץ fluidic. עבור analytes anionic, מובילה את האלקטרוליט (LE) חיץ נבחר שלuch כי אניונים שלה יש יותר ניידות electrophoretic יעיל יותר אניונים של אלקטרוליט נגרר (TE) חוצץ (ניידות אפקטיבית מתאר את מהירות סחיפה הנצפה של יון ולוקח בחשבון את המדינה יינון של יון, כפי שתואר על ידי Persat ואח' בפירוט . 13). לאחר כינון הממשק בין TE ולה, שדה חשמלי מוחל כך יונים לה טמפ להתרחק מהאזור הכבוש על ידי יוני te. יונים לדוגמה גזע ביניים ניידות יעילה לקראת יוני טה אבל אני לא מצליח לעקוף יונים לה טמפ, ולכן הם מתמקדים בממשק LE-TE (להלן "ממשק ITP"). יתר על כן, TE ואזורים לה טמפ טופס של מוליכות נמוכה בהתאמה גבוהה, אשר להקים שיפוע תלול שדה חשמלי על הממשק ITP. זה שיפוע בתחום preconcentrates מינים המדגם כפי שהן להתמקד. בחירה נכונה של תוצאות טה LE להתמקד וטיהור של מינים שאינם יעד ממוקד מינים אחרים, ובסופו של דבר ההפרדההפרדה ד מינים לדוגמה.
אנחנו כאן לסקור ITP עקרונות פיסיקליים בבסיס ולדון בשני מצבים סטנדרטיים של המבצע: "השיא" מצבי "מישור". במצב שיא, יחסית לדלל יונים מדגם להתמקד יחד בתוך חופפים פסגות צרים על הממשק ITP. במצב הרמה, יונים מדגם שופע יותר להגיע לריכוז המצב היציב ואת לבודד את הרמה, כמו אזורים סמוכים שהוזמנו על ידי ניידות יעילה שלהם. מצבי שיא הרמה נובעים מתוך פיזיקה בסיסית אחת, אלא לייצג משטרים שונים הנבדלות ריכוז אנליטי הראשונית ו / או את משך הזמן המוקצב הצטברות המדגם.
אנחנו הראשונים לתאר בפירוט השיא מודל הניסוי מצב ואז להראות assay מצב שיא החילוץ של חומצות גרעין מ – א ' תא קולי התרבות. אנו מסיקים על ידי הצגת מצב assay הרמה, שבה אנו משתמשים שאינם מתמקדים נותבים (NFT אזור) מינים לדמיין את ההפרדה ליוצרים quantitation של חומצות אמינו.
השיטות ITP שהוצג לאפשר זיהוי מהיר, רגיש, ויציב וטיפול מולקולות יוניים. האתגר העיקרי בשימוש ITP היא בחירה נכונה של מאגרים לה טמפ ו TE. ב ITP anionic, אנחנו בדרך כלל לבחור כלוריד כמו אניון מובילה כי היא חומצה חזקה עם הניידות המוחלטת גבוהה מאוד, ולכן יש מאפיינים מאוד לחיזוי. לכן, הבחירה חיץ anionic ITP הוא מופחת בדרך כלל בחירה נכונה TE counterion. עבור ניסויים התמקדות סלקטיבית, בחירה TE הוא קריטי כדי הרחקה של זיהום יונים. ביישומים שבהם מזהמים אינם נוכחים, נמוך ניידות TE יעיל מוביל לשיעור מהיר יותר של התמקדות. אנו ממליצים להשתמש הבאות, יחסית מחונך anionic יונים טה: MES, מגבים, HEPES, tricine. הבחירה של counterion משפיע הן pH מערכת וניידות TE יעיל. Counterions נפוצים הם טריס (pKa 8.1) ו-BIS טריס (pKa 6.4). מבחני הדורשים pH נמוך או גבוה, מומלץ פירידין (pKa 5.25) וethanolamine (pKa 9.5), בהתאמה. בלוחות 1 ו -2, עבור ITP anionic קטיוני, בהתאמה, אנו מסכמים כמה דוגמאות חיץ שימושיים. אנחנו לוקחים HCl כמו יון נתרן LE anionic וכפי קטיוני LE יון, ואנחנו מניחים 100 כוח יונית מ"מ למאגר LE.
הקורא יהיה לציין כי יונית מאגר כוח הפרוטוקולים שלנו (וגם לוחות 1-2) תמיד גדול או שווה ל 10 מ"מ. אמנם באופן תיאורטי את הפיסיקה של ITP חל על כוח יונית נמוך 10 מ"מ, מזהמים טבעיים (חומצה פחמתית למשל מתגובה בין מים דו תחמוצת הפחמן באטמוספירה) ליד רמה 1 mM לעתים קרובות להגביל את השימוש המעשי של מאגרים נמוכים כוח יוניים.
נציין, כי מנגנון התמרה האות אינו מוגבל מבחני שהוצגו בפרוטוקול זה. כפי שנאמר בקצרה חלק 5, במצב הרמה מטוהרים אזורי ניתן לאתר באמצעות שינוי המוליכות המקומי, absor UV, טמפרטורה bance, או אינדקס השבירה. בקבוצה שלנו, פיתחנו שיטה אשר מנצל ampholytes הספק ניאון לאיתור זיהוי רגיש של analytes ידוע. 5 בניסויים מצב שיא, בדיקות ספציפיות ניתן לתייג analytes ממוקדים. בדוגמה אחת, אנו משתמשים באלומות מולקולריות – בדיקות oligonucleotide כי לזרוח על ההכלאה רצף היעד שלהם – כדי לזהות DNA היעד או מולקולות רנ"א עם סגוליות גבוהה 11,18.
בעוד ITP היא איתנה יחסית פיזור הנגרמת על ידי זרימת הלחץ מונע EOF, EOF מוגזמת עלולה לגרום לקיפאון של ממשק ITP, שם מהירות EOF אומר הופך שווה למהירות ITP. 14 EOF חזקה כזו מתרחשת בעיקר בתנאים של pH גבוה וחוזק יוני נמוך. מסיבה זו, אנו ממליצים על שימוש מאגרים עם pH 8 או נמוך יותר ועם כוח יונית בסדר גודל של 100 מ"מ, אם נוח. מניסיוננו, PVP הואביותר ציפוי יעיל לדיכוי EOF שבבי בורוסיליקט. עם זאת, בגלל המאפיינים שלה סנון, PVP לא יכול להיות מתאים עבור יישומים מסוימים, כגון התמקדות הדנ"א הגנומי. בניסויים, אנו צופים כי התוספת של PVP יכול לצמצם במידה ניכרת את ניידות הדנ"א הגנומי המוחלט (עד כדי כך שהוא לא מתמקד). במקרים אלה ציפוי silanol כגון Sigmacote ב conjuction עם פעילי שטח (למשל טריטון X-100) יכול להיות גם יעיל בהפחתת EOF. 10
TE אניון (pKa -1) | ||||
Counterion חציצה (pKa 1) | MES (6.10) | מגבים (7.20) | HEPES (7.50) | tricine (8.15) |
ethanolamine (9.50) | 21.41 | 20.40 | 17.38 | 22.85 |
טריס (8.08) | 21.00 | 19.23 </ Td> | 15.84 | 17.56 |
BIS-טריס (6.40) | 18.22 | 10.41 | 7.30 | 5.23 |
פירידין (5.18) | 1.01 | 3.72 | 2.42 | 1.48 |
טבלה 1. ניידות גודל אפקטיבי (× 10 -9 מ '2 / V / s) של אזור מותאם אנליטי טהור ITP anionic שם LE הוא 100 מ"מ HCl ו 200 חציצה counterion מ"מ.
TE קטיון (pKa 1) | ||||
Counterion חציצה (pKa -1) | ethanolamine (9.50) | טריס (8.08) | BIS-טריס (6.40) | פירידין (5.18) |
MES (6.10) | 35.57 | 21.96 | 16.39 | 10.45 |
MOPS (7.20) | 35.47 | 20.92 | 9.76 | 3.93 |
HEPES (7.50) | 35.35 | 19.97 | 7.77 | 2.88 |
Tricine (8.15) | 34.77 | 16.72 | 4.50 | 1.44 |
טבלה 2. גודל ניידות אפקטיבית (× 10 -9 מ '2 / V / s) של אזור מותאם אנליטי טהור ITP קטיוני שבו LE הוא 100 מ"מ ו 200 נתרן חציצה counterion מ"מ.
The authors have nothing to disclose.
אנו בתודה להכיר במימון DARPA פוקוס בחסות מיקרו / ננו יסודות fluidics (MF3) מרכז תחת חוזה מספר N66001-10-1-4003, ומן DARPA מענק N660001-09-C-2082.
REAGENTS | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Distilled water | GIBCO | 10977 | RNase/DNase free |
Clorox Ultra | Clorox | 02489CT | |
sodium hydroxide (NaOH) | Mallinckrodt | 7708 | |
hydrochloric acid (HCl) | EMD Chemicals | HX0603-4 | |
Trizma base (tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
polyvinylpyrrolidone (PVP) | Polysciences Inc. | 06067 | MW 1,000,000 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
Alexa Fluor 488 carboxylic acid | Invitrogen | A20000 | |
tricine | Sigma-Aldrich | T-9784 | |
bis-tris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
EDTA | GIBCO | AM9260G | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
SYBR Green II | Invitrogen | S7564 | |
ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000 | |
Rhodamine 6G | Acros Organics (Geel, Belgium) | CAS 989-38-8 | |
L-Amino Acids | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4389986 | |
PCR primers | Integrated DNA Technologies | ||
EQUIPMENT | |||
Name | Company | Catalogue number | Comments |
Borosilicate microfluidic chip | Caliper Life Sciences Inc. | NS12A | Supplied with or without plastic caddy |
Vacuum pump | Gast | DOA-P104-AA | |
Sourcemeter | Keithley | 2410 | Constant current and constant voltage operation modes |
Inverted epifluorescent microscope | Olympus | IX70 | Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination |
Filter cube | Omega | XF115-2 | Excitation/emission: blue/green |
Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 022363204 | 1.5 mL capacity |
Centrifuge | Eppendorf | 5417C |
Table 3. Specific reagents and equipment.