RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA'lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi
Summary
RIP-Chip aracılığıyla RNA ilişkili kompleksleri izole ve tanımlamak için adım protokolü bir adım.
Abstract
Yüksek işlem dizileme ve verimli mikroarray gelişiminin bir sonucu olarak, küresel gen ekspresyon analizi veri toplama ve kolay bir kullanıma hazır formu haline gelmiştir. Ancak pek çok araştırma ve hastalık modellerinde, hedef genin mRNA kararlı durum seviyeleri her zaman doğrudan kararlı durum protein düzeyleri ile ilişkili değildir. Post-transkripsiyonel gen regülasyonu ikisi arasındaki farklılığın olası bir açıklamadır. RNA Bağlayıcı Proteinler (RBP) bağlama tarafından Driven, post-transkripsiyonel regülasyonu hedef mRNA ile ribonükleoprotein (RNP) kompleks oluşturarak mRNA lokalizasyonu, istikrar ve çeviri etkiler. RNP karmaşık hücresel özlerinden bu bilinmeyen de novo mRNA hedeflerin belirlenmesi anlayışı mekanizmaları ve RBP ve protein miktarı üzerine oluşabilecek etkisi fonksiyonları için kilit önem taşımaktadır. Bu protokol, s tanınabilir RNP immünopresipitasyon-mikrodizi (RIP-Çip) olarak adlandırılan bir yöntem önerilmektedirdaha bireysel araştırmacı için bir deney optimize etmek için seçenekleri ile birlikte pecific mRNA'ların, değişen deneysel koşullar altında, ribonükleoprotein kompleksi ilişkilidir. Bu önemli deneysel aracı sayesinde araştırmacılar, post-transkripsiyonel gen regülasyonu yanı sıra diğer ribonükleoprotein etkileşimleri ile ilişkili karmaşık mekanizmalar keşfedebilirsiniz.
Protocol
Discussion
Bu deneyde, optimizasyon ve deneyim doğası nedeniyle başarıyla amaçlanan sonuçları elde etmek için sadece garantili yolu olacaktır. Bu işlem birçok adım olarak, sıcaklık ve reaktifler ve ürünlerin etkin kullanım kritik önem taşır. Uygun planlama ve tekniğin uygulanması deney önerilen optimum sıcaklıkta uygun bir süre içinde yapıldı sigorta yardımcı olacak. RNA izolasyonu deneyler ile önemli bir sorunu RNaz azalmayla RNA'ların hassasiyetidir. Tüm reaktifler RNaz ücretsiz ve saklanan veya RNaz ücretsiz kaplarda kullanılan olması gerekir. Bu mRNA örnek bütünlüğünü sağlamak için önemli bir adımdır. Deney, doğru uygulanmak bile, bununla birlikte, arzu edilen sonuç RBP ve hedef mRNA arasındaki etkileşimin doğasını dolayı elde edilemez.
Bir potansiyel sorun düşük veya RIP-Chip izole RNA hatta hiçbir sinyal yaşıyor.Total RNA sinyali olabilir rağmen, bu boncuklar tarafından aşağı çekilerek yetersiz bağlayıcı protein sonucu olabilir. İlk sorun giderme adımı kullanılan hücresel lizat belirli RBP yeterli ifadesi olduğunu teyit etmektir. Teyit sonra, protein nihai NT2 yıkamadan sonra izole edilebilir ve 5 dk için Laemmli tampon ya da başka bir uygun denatüre edici tampon içinde yeniden asıldı ve 95 ° C'ye ısıtılmış. Western blot analizi yeterli ilişkili protein aşağı çekme sağlamak için giriş lisatı hem de negatif kontroller ile koordineli olarak bu örnekler üzerinde kullanılabilir.
Bundan başka, hücre parçalama bu bileşenlerin ulaşmak için gerekli olduğu için, normal olarak ayrılan proteinler ve mRNA arasında anormal ve istenmeyen etkileşimler için potansiyel sokulabilir. Bu etkileşimler potansiyel bağlamak ve nonspesifik etkileşimler aracılığıyla hedef mRNA veya bağlayıcı proteinler "içinize çekin" olabilir. Bu değişen co Ayrıca, proteinlerşulları çoklu varyasyonlarda katlayabilirsiniz ve bağlayıcı motifleri bunların etkileşimi engelleyerek, kendi hedef mRNA için erişilemez hale gelebilir. Bunların her ikisi de verimli çalışma yanı sıra bu istenmeyen etkileşimler sınırlamak için listelenen en uygun sıcaklıklar kullanmanın önemini güçlendirmektedir. Ayrıca, belli bir hedef protein için yıkama koşulları optimize etkileşim saflığı en üst düzeye çıkarmak için önemli olacaktır. Daha sıkı yıkama koşullarına tabi olabilir. Örneğin, yıkama tamponu SDS ya da sinyal çıkışı da spesifik olmayan etkileşimleri ve arka planı azaltmak için ürenin uygun bir miktarda ilave edilebilir. Bu deneycinin hedef RBP yanı sıra bunların tek fizyolojik koşullar altında hedef mRNA üzerinde tamamen bağlı olacaktır. Bazı koşullar örneklerinin hazırlanması belirtilmelidir belirli mRNA analizi araçları için uygun olmayacaktır.
Sonunda, olsa RIP RNA zenginleşmesine başarılı-RBP etkileşimleri, RIP (CHIP) yöntemi ile bilinen bir sorunu geçici mRNA hedeflere RBP belirli bağlayıcı etki tespit etmek yetersizliğidir. Çeşitli çapraz bağlama teknikleri benzersiz dizi hedef izole etmek için RIP takiben de kullanılabilir, ancak kısa dalga boyunda UV kullanımı nükleik asit hasara yol açma eğilimindedir. PAR-CLIP veya photoactivatable Ribonükleozit çapraz ve immuoprecipitation olarak bilinen yeni bir yöntem istikrarlı ve geçicidir hem RNA etkileşimi benzersiz bağlanma yerlerinin tanımlanmasına izin veren yeni doğmakta olan RNA'ya thiouridine dahil uzun dalga UV kullanır.
Genel olarak, RIP-Chip grubumuzun yanı sıra diğer birçok araştırma grubu tarafından RNA bağlayıcı proteinler ve mRNA hedefleri arasındaki etkileşimleri yalıtmak ve incelemek için kullanılan mükemmel bir araç olarak kurulmuştur. Doğa ve uygulamada hassas olsa da, bu işlemin uygun yürütülmesi son zamanlara kadar, inacc olmuştur bu RNP komplekslerin izolasyonu, verecektirkeşif ve analiz için essible.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Savunma Bakanlığı (Fikir Ödülü W81XWH-07-0406) – Ulus Atasoy için
NIH RO1 A1080870 – Ulus Atasoy için
NIH R21 A1079341 – Ulus Atasoy için
Missouri Kurumsal Fonlar Üniversitesi – Ulus Atasoy için
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M dithiothreitol | Fisher | BP172-5 | DTT |
| DNase 1 | Ambion | 2235 | RNase free |
| Ethylendiamine Tetraccetic Acid | Fisher | BP118-500 | EDTA |
| Glycogen | Ambion | 9516 | |
| 1 HEPES | Sigma | H3375-100G | pH 7.0 |
| Igepal Nonidet P-40 | USB | 78641 | NP40 |
| 1 M KCl | Fisher | BP366-500 | |
| 1 M MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| NT2 Buffer | *See Below | ||
| Polysome Lysis Buffer | *See Below | ||
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11873580001 | |
| Protein A Sepharose Beads | Sigma | P3391 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| RNase Out RNase inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | 40 U/μl |
| 1 M NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-500 | SDS |
| 1 M Tris-HCl | Fisher | BP153-500 | pH 7.4 |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | New England Labs | S1402S | VRC |
| Reagent Workup |
| Prepare reagents in RNase/DNase-free, DEPC-treated glassware |
| Polysome lysis Buffer |
| 100 mM KCl |
| 5 mM MgCl2 |
| 10 mM HEPES (pH 7.0) |
| 0.5% NP40 |
| 1 mM DTT |
| 100 units/ml RNase Out |
| 400 μM VRC |
| Protease inhibitor cocktail tablet |
| 5 ml of Polysome lysis buffer |
| Add 50 μl of 1 M HEPES (pH 7.0) |
| 500 μl of 1 M KCL |
| 25 μl of 1 M MgCl2 |
| 25 μl of NP40 |
| 4.7 ml RNase-DNase-free H2O |
| 50 μl of 1 M DTT |
| 12.5 μl of 100 U/ml RNase Out |
| 200 μl Protease inhibitor cocktail (dissolved according to manufacturer) |
| 10 μl 200 mM VRC (at time of use) |
| NT2 Buffer |
| 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) |
| 150 mM NaCl |
| 1 mM MgCl2 |
| 0.05% NP40 |
| 1 L of NT2 Buffer |
| 50 ml Tris (pH 7.4) |
| 30 ml 5 M NaCl |
| 1 ml 1 M MgCl2 |
| 500 μl NP40 |
| 820 ml RNase-DNase-free H2O |
References
- Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer. BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).
- Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis. Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).
- Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays. Methods. 26, 191-198 (2002).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera. Gene. 317, 79-87 (2003).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).
- Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. Advances in RIP-Chip Analysis. Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).
- de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).
- de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. HuR: post-transcriptional paths to malignancy. RNA Biol. 2, 11-13 (2005).
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors. Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).
- Hieronymus, H., Silver, P. A. Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery. Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).
- Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export. Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).
- Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability. Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).
