طريقة لعزل وتحديد من microRNAs، وmRNAs ومكونات البروتين من بروتين نووي ريبوزي مجمعات من مقتطفات خلية باستخدام رقاقة RIP
Summary
A خطوة خطوة لعزل بروتوكول وتحديد مجمعات RNA المرتبطة بها من خلال رقاقة-RIP.
Abstract
نتيجة لتطور الإنتاجية العالية وكفاءة تحليل تسلسل ميكروأري، أصبحت عالمية تحليل التعبير الجيني شكل سهلة ومتاحة بسهولة لجمع البيانات. في مجال البحوث والنماذج كثيرة المرض غير أن مستويات ثابتة من الدولة مرنا الجينات المستهدفة دائما لا ترتبط مباشرة مع ثابت مستويات البروتين الدولة. بعد النسخي تنظيم الجينات هو التفسير المحتمل لاختلاف بين الاثنين. مدفوعا من البروتينات ملزمة RNA ملزم (RBP)، بعد النسخي التنظيم مرنا يؤثر التوطين والاستقرار والترجمة من خلال تشكيل بروتين نووي ريبوزي (RNP) المعقدة مع mRNAs والهدف. تحديد هذه مرنا غير معروف نوفو دي من الأهداف مقتطفات الخلوية في مجمع RNP محورية لفهم آليات ومهام RBP وتأثيرها على الإنتاج مما أدى البروتين. هذا البروتوكول يحدد طريقة تسمى RNP مناعي-ميكروأري (RIP-رقاقة)، والذي يسمح لتحديد من لياليmRNAs وpecific المرتبطة في مجمع بروتين نووي ريبوزي، في ظل الظروف التجريبية المتغيرة، جنبا إلى جنب مع مزيد من الخيارات لتحسين تجربة للباحث على حدة. مع هذه الأداة التجريبية الهامة، يمكن للباحثين استكشاف الآليات المعقدة المرتبطة تنظيم الجينات في مرحلة ما بعد النسخي وكذلك التفاعلات بروتين نووي ريبوزي أخرى.
Protocol
Discussion
ونظرا لطبيعة هذا التحسين، والتجربة والخبرة تكون مضمونة فقط الطرق للحصول على النتائج المرجوة بنجاح. في العديد من الخطوات من هذا الإجراء، ودرجة الحرارة والمعالجة الفعالة للالكواشف والمنتجات هي ذات أهمية حاسمة. والتخطيط السليم وتنفيذ تقنية مساعدة تأكد من أن تم إجراء التجربة في إطار زمني مناسب في درجات الحرارة المثلى الموصى بها. ومن القضايا الرئيسية مع التجارب العزلة RNA هو حساسية من RNAs إلى تدهور من RNases. جميع الكواشف يجب أن تكون حرة وريبونوكلياز المخزنة أو المستخدمة في ريبونوكلياز خالية الحاويات. هذا هو خطوة حاسمة في ضمان سلامة العينة مرنا الخاص بك. حتى عندما يتم تنفيذ التجربة بشكل صحيح، ومع ذلك، قد لا يمكن تحقيق النتيجة المرجوة نظرا لطبيعة التفاعل بين الممارسات التجارية التقييدية وmRNAs وهدفها.
مشكلة واحدة محتملة هو وجود منخفض أو حتى أي إشارة من RNA عزلها تشيب-RIP.على الرغم من أنه قد تكون هناك إشارة من الحمض النووي الريبي مجموع، وهذا قد يكون نتيجة لعدم كفاية البروتين ملزمة يجري سحب من قبل الخرز. الخطوة الأولى هي استكشاف الأخطاء وإصلاحها للتأكد من أن المحللة الخلوية المستخدمة لديها التعبير الكافي للRBP محددة. بعد تأكيد، قد يتم عزل البروتين بعد غسل NT2 النهائي ومعلق في المخزن المؤقت أو آخر Laemmli العازلة المناسبة يبدل طبيعة ويسخن في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ويمكن استخدام تحليل لطخة غربية على هذه العينات المحللة في التنسيق مع المدخلات وكذلك الضوابط السلبية لضمان ما يكفي من هدم للبروتين المرتبطة بها.
وعلاوة على ذلك، لأن lysing الخلية هو مطلوب للوصول إلى هذه المكونات، قد يتم عرض إمكانية التفاعلات غير طبيعي وغير المرغوب فيها بين البروتينات وفصلها عادة مرنا. يمكن ربط هذه التفاعلات المحتملة و"امتصاص" mRNAs والهدف الخاص بك أو البروتينات من خلال التفاعلات غير محددة ملزمة. بالإضافة إلى ذلك، شارك في هذه البروتينات متفاوتةيمكن nditions أضعاف في أشكال متعددة والزخارف التي قد تصبح ملزمة لا يمكن الوصول إليها لmRNAs وهدفهم، ومنع تفاعلها. كل من هذه تعزيز أهمية العمل بكفاءة وكذلك الاستفادة من درجات الحرارة المثلى للحد من سرد هذه التفاعلات غير المرغوب فيها. بالإضافة إلى ذلك، سوف الأمثل لغسل الظروف لكل بروتين هدف معين تكون حاسمة لتحقيق أقصى قدر من التفاعل نقاء. قد تكون هناك حاجة غسل ظروف أكثر صرامة. على سبيل المثال، قد يتم استكمال العازلة غسل SDS أو مع مبلغ مناسب من اليوريا للحد من التفاعلات غير محددة والخلفية في الناتج إشارة. سيكون هذا تعتمد اعتمادا كليا على الممارسات التجارية التقييدية في الهدف المجرب وكذلك مرنا الهدف في ظروفها الفسيولوجية فريدة من نوعها. فإن بعض الظروف لا تكون مناسبة لبعض أدوات التحليل مرنا، والتي تجدر الإشارة في إعداد العينات.
وأخيرا، على الرغم من RIP ناجحا في إثراء RNARBP-التفاعلات، مشكلة معروفة بشكل جيد مع طريقة (CHIP) RIP هو عدم القدرة على التعرف على مجالات محددة ملزمة للRBP على الأهداف مرنا عابرة. ويمكن استخدام العديد من التقنيات عبر ربط تليها RIP لعزل الأهداف تسلسل فريد، إلا أن استخدام الأشعة فوق البنفسجية قصيرة الموجة يميل إلى أن يؤدي إلى تلف الحمض النووي. وهناك طريقة جديدة تعرف باسم CLIP-PAR، أو photoactivatable يشابك ريبونوكليوزيد وimmuoprecipitation، ويعمل منذ فترة طويلة موجة الأشعة فوق البنفسجية لدمج thiouridine إلى RNA الوليدة السماح تحديد مواقع الربط فريدة من التفاعلات RNA سواء مستقرة وعابرة.
وعموما، تم تأسيس RIP-الرقاقة، أداة ممتازة تستخدم لعزل ودراسة التفاعلات بين البروتينات RNA ملزم والأهداف مرنا من خلال مجموعتنا وكذلك العديد من المجموعات البحثية الأخرى. على الرغم من الطبيعة الحساسة في والممارسة، وحسن تنفيذ هذا الإجراء يحقق عزلة هذه المجمعات RNP، التي كانت حتى وقت قريب، كانت inaccessible لاكتشاف وتحليل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وزارة الدفاع (جائزة فكرة W81XWH-07-0406) – لأتاسوي اولوس
NIH RO1 A1080870 – لأتاسوي اولوس
NIH R21 A1079341 – لأتاسوي اولوس
جامعة ميسوري صناديق المؤسسية – لأتاسوي اولوس
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M dithiothreitol | Fisher | BP172-5 | DTT |
| DNase 1 | Ambion | 2235 | RNase free |
| Ethylendiamine Tetraccetic Acid | Fisher | BP118-500 | EDTA |
| Glycogen | Ambion | 9516 | |
| 1 HEPES | Sigma | H3375-100G | pH 7.0 |
| Igepal Nonidet P-40 | USB | 78641 | NP40 |
| 1 M KCl | Fisher | BP366-500 | |
| 1 M MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| NT2 Buffer | *See Below | ||
| Polysome Lysis Buffer | *See Below | ||
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11873580001 | |
| Protein A Sepharose Beads | Sigma | P3391 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| RNase Out RNase inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | 40 U/μl |
| 1 M NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-500 | SDS |
| 1 M Tris-HCl | Fisher | BP153-500 | pH 7.4 |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | New England Labs | S1402S | VRC |
| Reagent Workup |
| Prepare reagents in RNase/DNase-free, DEPC-treated glassware |
| Polysome lysis Buffer |
| 100 mM KCl |
| 5 mM MgCl2 |
| 10 mM HEPES (pH 7.0) |
| 0.5% NP40 |
| 1 mM DTT |
| 100 units/ml RNase Out |
| 400 μM VRC |
| Protease inhibitor cocktail tablet |
| 5 ml of Polysome lysis buffer |
| Add 50 μl of 1 M HEPES (pH 7.0) |
| 500 μl of 1 M KCL |
| 25 μl of 1 M MgCl2 |
| 25 μl of NP40 |
| 4.7 ml RNase-DNase-free H2O |
| 50 μl of 1 M DTT |
| 12.5 μl of 100 U/ml RNase Out |
| 200 μl Protease inhibitor cocktail (dissolved according to manufacturer) |
| 10 μl 200 mM VRC (at time of use) |
| NT2 Buffer |
| 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) |
| 150 mM NaCl |
| 1 mM MgCl2 |
| 0.05% NP40 |
| 1 L of NT2 Buffer |
| 50 ml Tris (pH 7.4) |
| 30 ml 5 M NaCl |
| 1 ml 1 M MgCl2 |
| 500 μl NP40 |
| 820 ml RNase-DNase-free H2O |
References
- Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer. BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).
- Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis. Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).
- Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays. Methods. 26, 191-198 (2002).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera. Gene. 317, 79-87 (2003).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).
- Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. Advances in RIP-Chip Analysis. Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).
- de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).
- de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. HuR: post-transcriptional paths to malignancy. RNA Biol. 2, 11-13 (2005).
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors. Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).
- Hieronymus, H., Silver, P. A. Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery. Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).
- Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export. Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).
- Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability. Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).
