Moxi Z Mini Otomatik Hücre Sayacı Kullanımı Memeli Hücre Sayımı, Hücre Boyutu ve Hücre Sağlık Belirlenmesi

1. Numunelerin Hazırlanması Hücre yoğunluğu aleti (3000 ila 500,000 hücre / mL Tip M kaset için, ya da 3.000 ila 2.500.000 hücre / S kaset tipi için mL) çalışma aralığı içinde kalacak biçimde ORFLO seyreltici ya da uygun bir seyreltici ile hücre süspansiyonu ile seyreltilir. 01:20 (M Tipi kaset) veya 1:5 seyreltme (Type S kaset) için seyreltme 1:5 bir seyreltme en memeli hücre hatları için tavsiye edilir, ancak uygun seyreltme hücre tipi ve tohum yoğunluğu bağlıdır. Doğru bir sayım için gerekli hacmi yaklaşık 75 uL olup. 2. Koşu Örnekleri Güç düğmesine basarak ve Ana ekranda görüntülenir tarafından Moxi Z çevirin. Tepsiye bastırın ve Moxi Z. Pipet 75μL örnek … ekranı göreceksiniz içine bir kaset yerleştirin. Kaset doldurma portu (mavi oval bir 75 uL örnek PipetiHangi kasetinin ucu bağlı olarak 1 ya da 2, etiketli) alet içine yerleştirilmiştir. Bunlar, 2 testleri için de kullanılabilir atılabilir kasetleri, bulunmaktadır. Not: Yeri ucu iyi ön dudak altında yakalanan böylece ~ 45 ° açıyla de, doğrudan yükleme içine pipet. Dağıtma zaman, kaset girmek için hava cepleri neden olabilecek şekilde vakumla sıvı dozaj arasında "ileri" alın değildir olması önemlidir. Bu dağıtım sırasında oldukça üzerinde sıvı formunda küçük bir boncuk (iyi giriş boyutu) olması tavsiye edilir. Çoğu memeli hücre sayımı için, başlamak için ekranın herhangi bir yerine dokunun. Çok küçük parçacıklar (4 ila 8 mikron M Tipi ve 3-8 mikron Type S için ortalama çapı ortalama çapı) sayma için Moxi Z Küçük Parçacık modunda çalıştırılabilir. Not: kaset tipi ekran üstündeki siyah çubuk endikedir. Bu modda, Moxi Z varsayılan olarak 2 ila 10 um çapı ölçekli ayarlar ve sayımı u gerçekleştirirküçük hücrelerin saptanması için optimize edilmiş parametreler şarkı. BURAYA TOUCH testi başlatmak ve bu modda çalıştırmak için Küçük Parçacık Modu düğmesine (siyah kare) tuşuna basın. Moxi Z testi başlayacak ve hücre sayımı sonuçları yaklaşık 8 saniye (M tipi kaset) veya 15 saniye (Type S kaset) içinde tamamlanmış olacaktır. Eğri Uydurma MVI ve hesaplamaları otomatik olarak başlayacak ve sadece birkaç saniye ek gerektirir. Uygun bir formda bulunduğunda, sonuçlar daha sonra otomatik olarak ekranda görüntülenir. Ayırıcı varsayılan kazanım modu yapmak için, Eğri Ayırıcı moduna geçiş yapmak için Kont düğmesine Fit basın. Bu noktada, kaset ünitesi çıkarılabilir. 3. Veri Yönetimi AutoMode ölçekleme kapalıysa, sonuçlar başlangıçta bir eğri uyum 2-34 m çaplı ölçeği (M Tipi kaset) üzerinde sayısı veya 2-26 μ için görüntülenirm (Type S kaset). Otomatik mod ölçekleme açıksa, o Moxi Z otomatik olarak tüm eğri-fit verileri görüntülenir sağlarken eğrisi-fit nüfusun genişliği en yakın aralığında yatay eksen (x ekseni) dönüşebilecek. AutoMode ölçekleme elle yüksek çözünürlükte sonuçlarını görüntülemek için, kapalı ise, 2-26 mikron simgesini (M Tipi) veya 2-18 mikron simgesini (Type S) dokunun. Not: Kaset tipi ekranın sol üst kısmında mavi kutu içinde gösterilir. Eğri yetenekleri gibi görsel verilerin nüansları ayırmak için kullanıcının yeteneğinde iyileştirmek için küçük parçacıkların hücreleri veya sayma takdirde önerilir. Yatay çözünürlük artan üzerine, ölçekleme düğmesini dinamik olarak mümkün olan x-ekseni ölçeği aralıkları arasında bisiklet sağlamak için ayarlar: 2-34, 2-26, 2-18, ve M Tipi kaset için 2-10 mikron veya 2 Type S kaset için -26, 2-18 ve 2-10 mikron. Bu özellik sadece availa olduğunuhemen bir hücre sayımı takip ble. Eğri-fit veya kapı bölge için sayın bilgileri (hücre / ml) histogramın sol tarafında küçük siyah bir kutu görüntülenir. Ortalama hücre boyutu bilgi histogramın sağ tarafında küçük siyah kutu görüntülenir. MVI değeri histogramın sağ üst köşesinde mavi bir kutu görüntülenir. Test küçük parçacık modunda çalıştırmak ise, MVI geçerli değildir ve "MVI = SPM" olarak gösterilir. Hücrelerin konsantrasyonuna MVI çalışma aralığı, "Aralığı MVI = yetersiz" bir mesajın dışındaysa Ek olarak gösterilir. Mevcut histogram kaydetmek için, Bitti simgesine dokunun. Bu XXX ilgili test sayıdır "Test XXX" bir isim ile verileri kaydeder. Elle kapısı histogram için, Curve Fit sayımı sonuçları düğmesine geçiş yapmak için dokunun. Bu Ayırıcı varsayılan satın mod yapar. Sonra inci kapıları ayarlamak veya dokunun her mavi yolluk işaretleyici kaydırınince kapısı ayarlamaları için e sağ ve sol ok (bu mavi yolluk işaretleyici dokunulduğunda görünür) işaretleri arasında sadece hücre sayılır. Histogram dikey ölçeğini otomatik olarak eğri-fit nüfus genlik göre tartılır. Bu dikey ölçeğini ayarlamak için, histogram bölgede tokatlamak ekranı aşağı veya yukarı. Eğri sığdırma modu ekranına geri dönme ve eğri uygun modu, varsayılan toplama modu yapmak için Gated Sayım sonuçları düğmesine dokunun. Sonra sonuçları kaydetmek ve Ana ekrana geri dönmek için Done simgesine basın. Sonuçlarını silmek için, kalıcı test sonuçlarını silmek için her zaman Sil simgesine basın. 4. Daha önce Edinsel Veri Analizi Kaydedilmiş bir testi açmak için, Ana ekranda Histogram simgesine basın. Dokuz kaydedilen histogramlarına simgeleri ekranda görüntülenir.Ilgi testi için uygun simgesine basın veya daha fazla test sonuçlarını görüntülemek için ikonlar Aşağı Page Up veya Page basın. Her histogram kaydettiğiniz nasıl bağlı olarak, Curve Fit Kont modu veya Gated Sayısı modunda da açılacaktır. Gated Kont modunda, yolluk belirteçler bağımsız olarak her mavi yolluk işaretleyici kaydırarak istenilen şekilde yerleştirilebilir. Otomatik Kapı istenen tepe üzerine dokunarak. Gated Kont ve Curve Fit Kont modları arasında geçiş yapmak için dokunun. Histogramın dikey ölçeğini ayarlamak için Yakınlaştırma ve Unzoom simgeleri basın. Dikey ölçek dikey olarak da aşağı yukarı ekran (artırmak için) veya (azaltmak için) bir parmak swiping tarafından değiştirilebilir. Sürekli test sonuçlarını silmek için Sil simgesine basın. Için Done simgesine basıntest sonuçları kapatın ve Ana ekrana geri dönmek. (Not: Yakınlaştırılmış görünümü kaydedilmez.) 5.. PC'ye veri aktarma Veri, bir PC veya Mac için Moxi Z USB kablosu takarak Orflo Moxichart uygulamasını kullanarak bir PC veya USB aktarım yoluyla aktarılabilir. Bluetooth transferi için (MoxiChart), ilk Moxi Z biriminin Ana ekranda Bluetooth simgesini basarak cihazı Bluetooth kimliğini belirlemek. Bilgisayarda, MoxiChart uygulamasını açın ve sağ üst köşede Bluetooth simgesini tıklayın. Sonra, Moxi Z Bluetooth kimliği karşılık cihaz seçin ve yüklenen dosyalar için hedef klasörü seçin. Moxichart otomatik Bluetooth bağlantısı ile belirtilen dizine tüm dosyaları transfer olacak. Bluetooth (MoxiChart) veya USB tarafından aktarılan dosyaları analy açılıp edilebilironlar biçimlendirilmiş, çünkü MoxiChart uygulama ile doğrudan zed veya. csv dosyaları, doğrudan ek / özel analiz için Microsoft Excel veya diğer veri analiz programları açılabilir. 6. Temsilcisi Sonuçlar Moxi Z hassas ve kesin değerlendirmek için, HEK-293 hücreleri, HeLa hücreleri, CHO-K1, maya, Jurkat E6-1 hücreleri, PC12, ve sayım 0-500,000 hücreleri arasında değişen konsantrasyonlarda sahip boncuk süspansiyonlar hassas kalibre / mL (Tip M kaset) ve 0-2-2.5e 6 hücre / ml (Tip S kaset) sayıldı ve tüm memeli hücrelerinin Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan (ATCC) elde edildi, bir Coulter Z2 ve Moxi Z. ile karşılaştırıldı ve kültür olarak daha önce 7-11 nitelendirdi. Kısaca, hücreler RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), MEM (HEK-293, HeLa) hücreler veya F12K (CHO-K1) hücrelerin çekirdek ortam ile 75 mm 2 doku kültür şişeleri içinde süspansiyon içerisinde kültüre edildi. Tüm medya ile tamamlanıyor% 10 fetal sığır serumu ve 100 U penicillin/100 mikrogram Streptomisin. Flasks% 5 CO2 ile 37 ° C 'de bir inkübatör muhafaza edildi. Hücreler 3 gün boyunca her pasajlanmağa devam edildi. Maya hücreleri (X5, C. albicans, Vin 13) bağışlanan ve hemen olarak verilmiştir kullanılmıştır. M Tipi kaset veri ve Type S kaset için ~ 2-2.5e 6 hücre / ml için ~ 500.000 hücre / ml İlk örnek konsantrasyonları Coulter Z2 kullanılarak oluşturuldu. Müteakip teorik konsantrasyon seviyesi fizyolojik tamponlar (ISOTON II ya da Hank'in dengeli tuz çözeltisi) ile seri seyreltiler vasıtasıyla hazırlandı. Her konsantrasyondaki, aynı örnekleri her iki sistem ile ölçüldü ve birbirlerine karşı çizilmiştir. Şekil 2'de görüldüğü gibi, güçlü bir doğrusal ilişki vardı (M Tipi r 2> 0,9886, Type S r 2> 0,9781) tüm örnekler için sayımları arasında. Konsantrasyonlar da Moxi Z ve Z2 her ikisi ile teorik / beklenen hücre konsantrasyonları ile karşılaştırılmıştır ( <strong> Şekil 3) ve daha göstermiştir güçlü bir doğrusal ilişki (M Tipi r 2> 0,9758, Type S r 2> 0,9774). Hassas değerlendirmek için, HEK-293 ve HeLa hücre sayımı Coulter Z2, Moxi Z, ve bir hemasitometre ile yapıldı. CV 200,000-300,000 hücre / ml aralığında 5 ayrı sayıları ile ölçülür ile Moxi Z (M Tipi kaset), Coulter Z2 ve hemasitometre kullanarak hücre sayıları varyasyon ortalama katsayısı (CV, n = 19) hesaplandı. Moxi Z küçük ortalama CV (Şekil 4) Z2 ile karşılaştırılabilir ve Coulter tabanlı sayma teknolojileri ile sadece ulaşılabilir hassasiyet yüksek düzeyde temsilcisidir. Moxi Z enstrüman boyutlandırma satın hassas, hassas kalibre polistiren boncuklar ölçümü yoluyla sonraki değerlendirildi. Moxi Z ortalama parçacık boyutu ölçümleri (n = 5) üretici rapor boyutları karşı grafiğe geçirildi. Görülebileceği gibi in Şekil 5, Moxi Z ölçümleri sürekli bir yüksek doğrusal korelasyon (r 2 = 0,9989) ile üretici değerler eşleştirilir. Boyutu ve sayısı bilgileri ötesinde, Moxi Z bir rapor Moxi Canlılık Endeksi (MVI) değeri ile memeli hücre kültürü bir sağlık reaktif gerektirmeyen, genel bir değerlendirme sağlar. Bu indeks toplam parçacık sayımı ile ilgili olarak ilgi popülasyonda hücrelerin sayısının oranı, bir elde edilir. MVI ölçüm yetenekleri göstermek için, MVI değerleri (M Tipi kaset) standart manuel ve flow sitometri ölü / canlı ölçüm teknikleri ile karşılaştırıldı. Ölü (<% 10 canlı) HEK-293 ve HeLa hücre popülasyonları 37 seyreltici (ISOTON II, Beckman Coulter) içeren bir besin içermeyen, sodyum florür ° C'de canlı hücrelerin gecede inkübasyonlar yoluyla oluşturulan Kontrollü teorik canlılık düzeyleri canlı ve ölü hücreleri ratiometrically karıştırma bilinen konsantrasyonları tarafından hazırlanmıştır. Resulting çözümler hemositometre sayıları ve akış sitometresi ölçümleri ile her iki nüsha halinde canlılık düzeyleri incelendi. Hemasitometre ölçümler% 0.1 Tripan mavi bir çözelti ve hücrelerin geleneksel bir 50/50 karışım kullanılarak yapılmıştır. Flow sitometri ölçümleri Viacount reaktif ve üretici tarafından belirtilen protokol (Merck) kullanarak bir Guava PCA sitometresi (Merck) kullanılarak yapıldı. Şekil 6'da gösterildiği gibi, HEK hücreleri ve HeLa hücreleri "için analog bir hemasitometre canlılığı yüzdelere MVI verilerin lineer bir formda" Pearson katsayısı değerlerinin (R 2) = 0,9937 ve r 2 = 0,9728, sırasıyla, R 2 idi. Bu sonuçlar, bu yaklaşım bir sitometresi veya hemositometre kullanılarak elde edilen canlı / ölü ölçümleri üstünlügümüz hücre canlılığı geniş bir yelpazesinde kültür sağlık bilgileri sağladığını göstermiştir. Tablolar ve Şekiller (Dittami ve ark, 2011). 15: <p class= "Jove_content"> Şekil 1.. İnce film Coulter Sayma: Elektrik akımı ince-film kaseti Hücre Algılama Bölgesi geçirilir. Hücreleri CSZ aracılığıyla tek bir dosya akışı gibi, voltaj anlık artışlar Moxi Z. ile ölçülür Şekil 2. Moxi Z sayıları Coulter Z2 sayıları karşılaştırılabilir. Hücre ve boncuk süspansiyonların Özdeş sayıları bir Coulter Z2 ve Moxi Z. hem kullanılarak sayıldı Moxi Z sayıları sayısı değerleri (n = 3-4) Ortalamalı göre çizildi Coulter ilgili Z2 sayımı ve doğrusallaştırma r 2 değerleri tespit edilmiştir. A) M Tipi kaset – 0 konsantrasyon aralığı – 500.000 hücre / ml. B) Type S kaset – 0 konsantrasyon aralığı – 2-2.5e 6 / ml.Error Barlar işaret ± 1 standart sapma. <p class="jove_content"> Şekil 3. Moxi Z konsantrasyonu ölçümleri teorik hücre konsantrasyonları vs. A) Type M kaset – Teorik konsantrasyonu değerlerinin bir başlangıç ​​500,000 hücre / ml numunesinin seri seyreltiler hazırlandı B) Type S kaset -. 2.5e 6 hücre / ml örnek – Teorik konsantrasyonu değerlerinin bir ilk 2 seri seyreltiler hazırlandı. Hata Barlar ± 1 standart sapma gösterir. Şekil 4. Coulter Z2, Moxi Z (M Tipi kaset) ve hemositometre için Değişim Katsayısı. Her yaklaşım için HEK-293 ve HeLa hücre sayıları varyasyon ortalama katsayısı (CV, n = 19) ayrı 5 ölçülen özgeçmişleri ile hesaplandı 300.000 hücre / ml aralığı – 200.000 içinde HEK-293 ve HeLa Hücreleri sayar. Hata Barlar ± 1 standart sapma gösterir. <p class = "jove_content"> Şekil 5. Moxi Z-Moxi Z kullanılarak partikül boyutu ölçüm Hassas boncuk büyüklüğü ölçülür (M Tipi kaset) vs üreticisi boncuk boyutu bildirdi. Hata Barlar ± 1 standart sapma gösterir. 6 Şekil. MVI kullanarak Kültür Sağlık Değerlendirmesi – Bir hemasitometre kullanarak görsel, tripan-mavi lekeli canlılığı sayımları karşı MVI ölçümler (M Tipi kaset) ve Guava PCA Viacount canlılığının karşılaştırılması.