Microplate 응고 분석을 사용하여 인간의 플라즈마에 반영 V 활동의 측정
Summary
이 연구는 이전에보고되지 않은 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 FV 응고 활동을 측정하는 새로운 microplate 분석에 대해 설명합니다. 방법은 지속적으로 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 405nm에서 흡광도의 변화를 측정 할 수있는 운동 microplate 리더를 사용합니다.
Abstract
부상에 대응하여, 혈액 응고가 활성화하고 혈액 응고 단백 분해 효소, 트롬빈의 생성의 결과입니다. 섬유소로 트롬빈 cleaves의 피브리노겐 이는 출혈을 중지 불용성 응고를 형성한다. 의 활성 형태, FVa에서 요소 V (FV)는 prothrombinase 1, 2의 일부로 섬유소 응고 형성시 트롬빈 생성의 단백 분해 효소 FXa과 가속을위한 중요한 cofactor이다. 수동 FV의 assays는 3, 4 설명 된 있지만 시간이 소요 및 주관적입니다. 자동 FV의 assays는 5-7보고 있지만 분석기 및 시약 비싼 일반적으로는 응고 시간,하지 섬유소 형성의 속도와 범위를 제공합니다되었습니다. microplate 플랫폼 때문에 편리 효소 촉매 이벤트를 측정하는 것이 바람직하다, 시간, 비용, 작은 볼륨, 지속적인 모니터링, 9, 8 높은 처리량. Microplate의 assays는 응고의 용해 10, 혈소판 응집에 대해보고 된11 및 응고 요인 12,하지만 인간의 플라즈마에 FV 활동에 대한. 방법의 목적은 인간의 플라즈마에서 피브린 형성하는 동안 FV 활동을 측정 microplate 분석을 개발하는 것이 었습니다.
이 소설 microplate 방법은 인간의 플라즈마에 FV 활동의 간단 저렴하고 빠른 분석을 설명합니다. 검정은 인간의 플라즈마에서 피브린 형성 (그림 1) 13시 405nm에서 흡광도의 변화를 모니터링하는 운동 microplate 리더를 활용합니다. 검정 정확하게 시간, 초기 속도, 그리고 섬유소 응고 형성의 정도를 측정합니다. 그것은 플라즈마 만 μl 양을 필요로 6 분에 완료, 높은 처리량이, 24 80pM FV에 민감하며,의 양을 측정 실수로 활성화 (1 단계 활동)과 트롬빈 활성화 FV (2 단계 활동 1 단계 활동) -)의 총 기능 활동의 전체 평가 (2 단계 활동을 구하십시오.
전파 intravascular 응고 (DIC)가 가장 많이 기존의 감염을 14 일부터 개발 획득 coagulopathy입니다. DIC는 기존의 병리 15 위 가난한 예후 (豫后)와 증가 사망률과 연결되어 있습니다. 검정은 DIC, FV 1 단계, 2 단계 및 총 활동 9 환자 일반 풀링 된 인간에 비해 각각 54 %, 44%, 42 %의 평균에 감소 된 것을 보여주기 위해 사용되었다 참조 플라즈마 (NHP).
FV microplate 분석은 응고 인자의 활동을 측정 할 쉽게 적응합니다. 이 분석은 연구 및 임상 설정에서의 활동의보다 정확하고 완벽한 측정을 통해 FV 생화학 대한 우리의 이해를 높일 수 있습니다. 이 정보는 긍정적 이전에 진단 및 DIC와 같은 응고 장애에 대한 더 효과적인 치료법의 개발을 통해 의료 환경에 영향을 미칠 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
운동 microplate 분석 방법이 소설하지 않은 (FV 1 단계 분석) 또는 인간의 플라즈마의 샘플에서 FV 응고 활동의 측정을위한 신속한 저렴하고 편리한 기술의 발전을 설명하는 것은 의도적으로 추가 된 트롬빈 (FV로 활성화 된 2 단계 분석). 검정은 운동 microplate 리더를 활용하여 필요한 모든 자료와 시약은 상업적으로 사용할 수 있습니다 또는 집에서 만들어 질 수있다. 검정은 지속적으로 405nm에서 섬유소 응고 형성 동안 플라즈마의 빛 분산의 변화를 모니터링합니다. microplate 분석 작은 플라즈마 샘플 볼륨을 (μl)를 사용의 장점을 가지고 있으며 동시에 여러 샘플 (12)의 분석을위한 의무입니다. 고가의 장비와 시약은 (자동 분석기 및 팩터 – 결함 플라즈마)를 사용하는 경우이 검정 속성은 유리이다; 만 작은 샘플 볼륨을 사용할 수 있습니다 (환자 플라즈마) 또는 FV 정화 F에는 샘플의 큰 번호 (분석ROM 플라즈마).
FV microplate 분석은 빠르고 편리있는 추가 이점을 가지고 있으며, 필요한 구성 요소의 절연 및 정화를 필요로하지 않습니다. 수동 경사 관 3, 4,보고 된 자동 5-7 FV의 assays에 비해, FV microplate 분석이 응고 시간 비교 유용한 범위 (25-75 초) 및 샘플에 해당 FV 수준 (0.5-0.005 단위가 / ML) 및 감도 / 검출 한계 (20 80pM). 응고 형성 3, 4의 주관적인 시각적 평가에서 고통을 수동 경사 관 FV의 assays에 비해, FV microplate 분석은 응고 시간을 객관적이고 정량적 측정, 초기 속도, 그리고 섬유소 응고 형성의 정도를 할 수 있습니다. 5-7 고가의 분석기 및 시약의 요구로 고통 자동 FV의 assays에 비해, FV microplate 분석의 시약 및 재료는 저렴하고 필요한 모든 자료는 purcha 수 있습니다상업적으로 SED 또는 집에서했다. 수동 경사 관 3, 4 및 자동화 5-7 FV의 assays는 일반적으로 만 응고 형성을위한 시간을 제공,하지 시간, 초기 속도, 그리고 정확하게 FV microplate 분석과 spectrophotometrically 측정 섬유소 응고 형성의 범위. 마지막으로, 3,4 경사 관 수동 및 자동 5-7 FV의 assays는 플라즈마 샘플을 한 번에 하나의 FV 활동을 측정 할 수없는 고통, FV microplate 분석은 높은 처리량 의무가 있으며, 12 샘플 수 있습니다 반면, 동시에 assayed.
microplate 분석은 9 DIC 환자 플라즈마의 FV 때문에 지연 응고 시간 및 FV 1 단계 분석에서 응고 형성의 낮은 초기 속도의 조합의 NHP에보다 적극적이라고 설명하는 데 사용되었습니다. DIC 환자 플라즈마의 FV 2 단계 분석에서 응고 형성의 초기 요금은 NHP에서 변경되지 않았습니다. DIC patien에서 응고 형성의 범위t 플라즈마는 FV 1 단계 및 2 단계 assays의 NHP에서 변경되지 않았습니다. FV 감소 1 단계, 2 단계 및 총 활동이 획득 혈액 장애의 pathogenesis 동안 다른 연구에 따라 증가 FV 소비 19 및 / 또는 불 활성화 여섯으로 인해 발생했을 수 있습니다. DIC 플라즈마에서 응고 형성의 정도는 같은 NHP와 함께 관찰 그대로였다 감안할 때,이 변수는 대부분의 FV-결함 플라즈마에서 피브리노겐 농도의 결과 가능성과 환자 플라즈마의 특성에 관한 아니 었습니다.
microplate 분석의 결과는 인간의 플라즈마의 샘플에서 FV 활동의 측정은 FV 1 단계 분석에서 응고 형성 시간과 초기 속도와 FV 2에서 응고 형성과 총 활동 시간에서 구할 수 있습니다 표시 – 단계 분석. 그것은 t의 응고 형성의 정도에 따라 플라즈마 샘플에 FV 활동의 양적 측정을 얻기 위해 불가능했다그는 FV 1 – 및 2 단계 assays 또는 FV 2 단계 분석에서 응고 형성의 초기 속도. 모든 반응은 약 0.35의 응고 형성의 동일한 범위에 도달 감안할 때 – 전에 초기 흡광도와 thromboplastin과 칼슘 염화물 추가 후 최대 흡광도 사이에 0.45 단위, 응고 형성의 범위 측정에 FV 활동의 양적 평가를 제공하지 않습니다 플라즈마 샘플을 제공.
소설 microplate 분석은 인간과 동물 플라즈마로부터 정화하는 동안 인간의 플라즈마와 분수의 샘플에서 FV 활동의 측정을위한 연구 및 임상 설정에서 사용을 찾을 수 있습니다. microplate 분석은 시간, 초기 속도, 그리고 응고 형성의 정도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다, 매개 변수는 일반적으로 수동 경사 관 assays 및 자동 응고 분석기로 동시에 모니터링 없습니다. 이 정보는 응고 형성 이벤트 기간 동안 FV의 참여의 전체 정량 평가의 자세한 내용을 제공합니다인간의 플라즈마에 이상이 이전에 3-7보고되었습니다. 플라즈마의 샘플에 FV 활동 또는 FV 또는 FVa을 정화로 큰 변화를 측정 할 때이 정보는 연구와 임상 실험실 모두에서 특히 중요합니다. FV microplate 분석도 특성화하고 측정 FV 및 FVa을 활성화하거나 비활성화 할 수 있습니다 화합물을 정맥 혈전증에 대한 위험에 환자의 FV 활동을 측정 FV 레이덴 돌연변이의 결과로 20, 21하고의 활동을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다 플라즈마로부터 정화 기간 동안 FV.
FV microplate 분석은 해당 요소 – 결함 플라즈마를 사용하고 섬유소 형성을위한 시약을 시작 외부, 고유, 또는 일반적인 경로에서 모든 응고 인자의 활동을 측정 할 쉽게 적응합니다. 분석 연구 및 임상 실험실에서의 활동의보다 정확하고 완벽한 측정을 통해 FV 생화학 대한 우리의 이해를 높일 수 있습니다. 최고의지적인,이 정보는 긍정적 이전에 진단 및 DIC와 같은 응고 장애와 고통 사람들을위한 더 효과적인 치료법의 개발을 통해 의료 환경에 영향을 미칠 것입니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구는 전문 개발 및 연구 시작 자금 기술 온타리오 연구소 (UOIT)의 대학에서 박사 존 A. Samis와 이리나 레비 타스 라에 건강 연구 건강 전문 학생 연구 상 캐나다 연수를 지원했다. 저자는 동영상을 준비 그녀의 도움 섀넌 에버렛 (Everett)을 (교육 및 학습 센터, UOIT)을 인정합니다. 저자는 자신의 멘토링, 통찰력, 그리고 도움이 토론에 박사는 마이클 E. Nesheim을 (생화학 부, ON 여왕의 대학, 킹스턴)을 인정합니다. 저자는 또한 연구에 사용 된 DIC 환자 플라즈마를 제공하는 박사 쳉 호크 토를 (로알 드 달의 Haemostasis 및 혈전증 센터, 로얄 리버풀 대학 병원, 리버풀, 영국)을 인정합니다.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (Optional) |
| Kinetic microplate reader | Molecular Devices | Spectra Max 190 | SOFTmax PRO 4.3 LS software |
| Normal pooled human reference plasma | Precision Biologicals | CCN-10 | |
| Trisodium citrate | Becton Dickenson | B10242 | |
| EDTA | Becton Dickenson | B10093 | |
| FV-deficient human plasma4 | Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C. | ||
| 3 and 60 ml syringes | Becton Dickenson | 309585 and 136898 | |
| Butterfly apparatus | Vacutainer | 367251 | 20 gauge |
| HEPES | Sigma/Aldrich | H-3375 | |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Thromboplastin | Trinity Biotech | T1106 | Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C. |
| Calcium chloride | Becton Dickenson | B10070 | |
| Human thrombin15 | From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol. | ||
| Dialysis membrane | Fisher | 21-152-6 | 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m. |
| Template holder and removable 8 well strips. | Nunc | 14-245-63 and 469957 | |
| ELISA washing trays | BioRad | 224-4872 | |
| 1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. | Sarstedt | 72690 and 62554205 | |
| Multichannel pipette | Fisher | 2703630 | 8 channel model. |
References
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