Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

A. Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) (bkz. Şekil 1) 1. Kromatin Bağlı Proteinler ve Hücre Toplanması Çift Crosslinking (Video 02:10) Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) bir Chia-PET kütüphane yaptırdığı katılan ilk kritik adımdır. Bu adım karmaşıklık, arka plan gürültü düzeyini azaltmak ve özgüllüğünü eklemek önemlidir. ChIP hazırlanması ilgi hücre tipi ve faktör için optimize gerekir. Bu protokol, laboratuvarda yapılmıştır MCF-7 hücreleri 9 dan hazırlanmış RNA polimeraz II Chia-PET kütüphane dayanmaktadır. Çıkan kitaplığı yeterli karmaşıklık olduğundan emin olmak için, biz ChIP malzeme hazırlamak için 1 x 10 8 hücre kullanmanızı öneririz. Ve hedef hücre hattı ile ilgili olarak, elde edilen verim 100 ng 300 ng arasında olabilir. Biz, 100 ng çip en az bir eş için kullanılması gerektiğini tavsiyesıralama sırasında fazlalık en aza indirmek için daha az 20 PCR döngüleri ile Chia-PET kütüphanesi nstruct. ChIP malzemenin yüksek miktarda kütüphanelerinin kalitesinin iyileştirilmesi, artıklık daha da düşürülmesi için izin verecektir. Fosfat ile iki kere 1 x 10 8 MCF-7 hücreleri (2 x 10 7 hücreleri, beş 500 cm kare plakalar 2 eşdeğer) yıkayın tamponlu tuzlu su (PBS), 37, önceden ısıtılmış ° C. 1.5 mM ile çapraz bağ MCF-7 hücreleri taze kimyasal bir çeker ocak içinde dönme ile oda sıcaklığında (22 ° C), 45 dakika için EthylGlycol bis (SuccinimidylSuccinate) (EGS)) hazırlanır. Kimyasal bir çeker ocak içinde dönme ile oda sıcaklığında (22 ° C) 20 dakika süreyle% 1 bir son konsantrasyon% 37 formaldehit ekleyin. 200 mM son konsantrasyon ile 2 M glisin eklenmesi ile çapraz bağlayıcılar dindir. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe(22 ° C) rotasyon ile. Bir atık balonun içine su verilmiş crosslinkers atın ve soğuk PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Kazıma PBS ve hasat hücreleri atın. Buz üzerinde hasat hücreleri tutun. Hücre toplama maksimize etmek 5ml PBS (proteaz inhibitörleri ile ("+ PI") üreticinin talimatlarına göre eklenen) ile plaka durulayın. 4 de 10 dakika boyunca 1,800 x g (3,000 rpm) ile Pelet hücreleri ° C. Süpernatantı atın ve hücre lizis geçin. Alternatif olarak, -80 ° C'de saklayın topak 2. Hücre Lizis (Video 04:15 de) Pelet yeniden süspanse iyice pipetleme ile 15 ml% 0.1 SDS lizis tamponu (50 mM HEPES pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 1 Triton X-100,% 0.1 Sodyum deoksikolatın,% 0.1 SDS + PI) içinde. 4 ° C'de 15 dakika boyunca döndürme Pelet 800 x hücreleri lize4 de 10 dakika g (2,000 rpm) ° C. Süpernatantı atın ve bir kez olarak adım 2.1 ve 2.2 başına hücre lizis tekrarlayın. İzole edilen nükleer pelet Nükleer lysis için hazır hale gelir. -80 Alternatif olarak, mağaza pelet ° C. 3. Nükleer Lizis (Video 05:00 'te) Nükleer parçalanma kromatin parçalanması önce çapraz kromatin serbest bırakmak için yapılır. Nükleer membran yokluğunda, çapraz bağlı kromatin yumuşak koşullar kullanılarak sonike edilmiş olabilir. Bozulmamış çekirdekler santrifüjlemeden sonra atılır çünkü Bazen, sonication kuvvet halinde nükleer membran parçalamak için yeterli olmayabilir, daha az kromatin elde edilecektir. Bununla birlikte, farklı hücre tiplerinin farklı koşullar gerektirir. Yeniden süspanse izole çekirdekler topak 15 ml,% 1 SDS lizis tamponu (50 mM HEPES pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 1 Triton X-100,% 0.1 Sodyum Deoxycholate,% 1 SDS + PI). Bir yüksek hızlı santrifüj tüpüne (Oak Ridge, santrifüj tüpüne (polipropilen)) ile çekirdekler süspansiyon aktarılır ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca döndürmek Pelet 4 ° C'de 30 dakika boyunca 47.810 xg'de (20.000 rpm) çekirdekler pelet lize Bir P1000 pipet ucu ile Durusu süpernatant ve mola pelet. 30 ml% 0.1 SDS Lizis Tampon (+ PI) ile pelet yıkayın. 4 ° C'de 15 dakika boyunca döndürme 4 ° C'de 30 dakika boyunca 47.810 x g'de (20000 rpm) Pelet kromatin Süpernatantı atın ve kromatin parçalanması geçmeden önce 3.6 için adım 3,4 olarak başına bir kez yıkayın tekrarlayın. Alternatif olarak, -80 mağaza kromatin pelet ° C. 4. Kromatin parçalanması (Video 07:03 itibariyle) Bir 14 ml polistiren yuvarlak alt test tüpüne aktarın kromatin pelet. Kromatin pe 1 ml% 0.1 SDS Lizis Tampon (+ PI) eklellet. Bu sonication verimliliğini etkiler olarak karışımda hava kabarcığı vardır emin olun. Bir Branson Dijital Sonifer Hücre bölücü (amplitüd% 35, 9 dakika (30 saniye, kapalı 30 saniye)) ve yaparak aşırı ısınmayı önlemek için her zaman örnekleri soğuk tutmak ile 200 ila 600 baz çifti bir boyuta Shear kromatin-DNA soğuk bir odada sonication (bkz. Şekil 2). Kromatin bir kısım Ters-çapraz bağ ve aşağıdaki adımlarla parçalanma verimliliğini kontrol. (Aşağıdaki adımlar, video gösterilmez). Sonication sonra kromatin kısım 10 ul. Santrifüj 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16.110 xg'de (13.200 rpm) kromatin sonicated Yeni bir tüp supernatant aktarın ve Proteinaz K çözeltisi 2 ul ekleyin. 50 dakika 30 ° C de inkübe % 1.5 agaroz jel üzerinde ters çapraz kromatin giderin. Repeat sonication DNA boyutları beklenenden daha büyükse. 4 az 30 dakika boyunca 16.110 x g'de (13200 rpm) santrifüje kalan lisatı ° C ve transfer manyetik boncuklar ile preclearing önce yeni bir tüp içine kromatin (süpernatant) sonike. Yeterli kromatin bir ChIP başlatmak için toplanan ° C kadar Alternatif mağaza -80 kromatin sonicated. 5. Beads Antikor Yıkama, Preclearing ve Kaplama (Video 08:17 itibariyle) Kromatin ve Preclearing Tek bir IP için manyetik protein G boncuk 300 ul kullanın. 5 ml Boncuk (PBS,% 0.1 Triton X-100) Tampon Yıkama ile üç kez boncuk yıkayın. Manyetik protein G boncuk içeren bu ve gelecek yıkar aşağıdaki adımlardan oluşur. Manyetik boncuk kurumasına yok olun. Bir manyetik parçacık konsantratörü kullanan boncuk Reclaim. Dsüpernatant iscard. Tamponu ile boncuk tekrar. 4 ° C'de 5 dakika boyunca döndürme 4 az 1 dakika süreyle 129 xg'de (800 rpm) santrifüjleyin ° C Bir manyetik parçacık konsantratörü kullanan boncuk Reclaim. Süpernatantı atın. Boncuk, kromatin bağlayıcı arka planı kaldırmak için, yıkanmış boncuklar ile sonicated kromatin birleştirin. Kantitatif PCR (qPCR) ile sonraki zenginleştirme onay için "giriş" sonicated kromatin 10 ul tutun. 4 ° C'de depolayın 4 gecede Döndür ° C. Santrifüj 4 ° C'de 1 dakika için 129 xg (800 rpm) kromatin sonicated Manyetik parçacık konsantratör tüpü üzerine yerleştirin. Manyetik Beads Kaplama Antikor Taze bir tüp manyetik protein G boncuk tablet 300 ul. Boncuklar 5ml yıkama tampon maddesi (PBS,% 0.1 Triton X-100) ile üç kez boncuk yıkayın. Boncuk Yıkama Tamponu eşdeğer hacmi (adım 5.1.3 gibi) ekleyin. RNA polimeraz II (8WG16) monoklonal antikor 35 ug ekleyin. 4 gecede Döndür ° C. 5 ml Boncuk Yıkama Tamponu ile iki kez antikor-kaplı boncuklar yıkayın. Bir manyetik parçacık konsantratörü kullanan antikor kaplı boncuklar Reclaim. 6. Kromatin immünopresipitasyon (Video 10:03) Karmaşıklığı ve arka plan gürültü düzeyini azaltmak için spesifik protein faktörlerine karşı antikorlar yakınlığı ligasyonu 6 öncesi belirli ilgi kromatin parçaları zenginleştirmek için kullanılır. Burada, monoklonal bir fare RNA polimeraz II kullanılırproteinin başlangıç ​​şeklinde tanınan antikor (8WG16). RNA polimeraz II, kütüphane özgüllüğü sağlayan artabilir ilişkili zenginleştiren DNA parçaları ile aktif destekçileri ve bunların düzenleyici bölgeler 9 arasında uzun menzilli kromatin etkileşimlerinin belirlenmesi. Bir manyetik parçacık konsantratör yardımı ile antikor-kaplı boncuklar tampon yıkama atın. Aktarım antikor-kaplı boncukların (adım 5.2.7 dan) ile manyetik parçacık konsantratör yardımı ile kromatin (adım 5.1.6 süpernatanıyla) sonike. 4 gecede Döndür ° C. 7. Immunoprecipitated DNA-Protein Kompleksi Yıkama ve Elüsyon (Video 11:13) 5 ml% 0.1 SDS lizis tamponu ile üç kez kromatin-immunoprecipitated boncuk yıkayın. 5 ml tuz Yıkama Tamponu (50 mM HEPES pH 7.5 ile bir defa yıkanır boncuk, 350 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 1 Triton X-100,% 0.1 Sodyum deoksikolatın,% 0.1 SDS). 5 ml lityum klorür Yıkama Tamponu (10 mM Tris, pH 8.0, 250 mM LiCI, 1 mM EDTA,% 0.5 Nonidet P-40,% 0.5 Sodyum deoksikolatın) ile bir kez boncuk yıkayın. 1 ml TE Tampon ile tampon ve tekrar süspansiyon yıkanmış boncuk yıkayın atın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca döndürme Örnek miktarının ve ChIP zenginleştirme onay için hazır. Yeterli ChIP malzeme örnek Chia-PET kütüphane içine inşa edilecek hazır, tahsil edilmiştir. Bu adım önemlidir, ve başarılı Chia-PET kütüphane yapım sağlamak için yapılmalıdır. ChIP zenginleştirilmiş boncuk 4 yukarı 2 haftaya kadar saklanabilir ° C miktarının, ChIP zenginleştirme kontrolleri ve yeterli materyal birikimi gören süre. Zehir ve ters-kroslink "girdi" DNA ve ChIP-zenginleştirilmiş boncuklar aşağıdaki adımları ile. (Aşağıdaki adımlar video gösterilmez.) 200 ul ChIP, Seyreltme Tampon maddesi (50 mM Tris pH 8.0, 10 mM EDTA,% 1 SDS) ile ChIP-zenginleştirilmiş boncuklar% 20 Zehir. 37 de 30 dakika döndürme ° C. 4 az 1 dakika boyunca 6.100 xg'de (800 rpm) yıkandı boncuk santrifüjleyin ° C Manyetik parçacık konsantratör yardımıyla yeni bir tüp Elüsyonlanan ChIP kompleksleri (süpernatant) aktarın. 50 de 2 saat için 2 ul Proteinaz K (0.2 g / ml son konsantrasyon) ° C ile ters-çapraz bağlayıcı "girdi" ile yıkandı, ChIP kompleksleri Transferi ters çapraz "girdi" DNA ve Yıkanan ChIP DNA 2 ml MaXtract Yüksek Yoğunluklu içine (sırasıyla). Kimyasal bir davlumbaz tüplere 200 ul 25:24:1 Fenol-Kloroform-İzoamil Alkol pH 7.9 ekleyin ve iyice karıştırın tersine çevirin. Oda sıcaklığında 16.110 x g'de (13200 rpm) ile 5 dakika için tüpler Spin. Yeni bir tüp üst sulu faz aktarın ve çökelti çapraz DNA zekâ tersineh 20 ul 3 M sodyum asetat pH 5.5, 200 ul izopropanol ve 1 ul 15 mg / ml Glycoblue. 4 ° C'de 16.110 x g (13200 rpm) ile 30 dakika için 30 dakika süre ile pellet DNA için -80 ° C sıcaklıkta inkübe Izopropanol çökeltilmiş DNA santrifüjünden sonra 20 ul TE tamponu içinde iki kere% 75 buz soğukluğundaki etanol ile yıkama ve DNA pelet tekrar süspansiyon DNA pelet. PicoGreen assay 10 ile "giriş" DNA (adım 5.1.3) ve ChIP DNA quantitate. Nitel PCR (qPCR) ile bir zenginleştirme kontrolü yapın. Eşli-End Tag Dizileme (Chia-PET) kullanarak B. Kromatin Etkileşim Analizi Videonun ikinci yarısında bir Chia-PET kütüphane yapımında anahtar adımlar vurgular. 1. ChIP DNA Fragments sonu küntleşme Video Bu bölüm iki m vurgulamaktadırain noktaları, manyetik boncuk içeren enzimler kaldırmak için manyetik boncuk yıkama ve bir önceki reaksiyon (Adım 1.1, videonun 12:22-00:54) ve enzimatik reaksiyonların kurma prosedürünün tuz tamponlama bir adım-adım prosedürü Reaksiyon karışımı, (Basamak 1.2, video, 12:54-13:25) içinde. Buz TE Tampon ile bir kez ChIP-zenginleştirilmiş boncuk yıkayın. Manyetik boncuk içeren bu ve gelecek yıkar aşağıdaki adımlardan oluşur. 4 az 1 dakika boyunca 6.100 xg'de (800 rpm) santrifüjleyin ° C Bir manyetik parçacık konsantratörü kullanan boncuk Reclaim. Süpernatantı atın. Boncuk tampon ekleyin. Eylem getirerek tamponu ile boncuk karıştırın. 4 az 1 dakika boyunca 6.100 xg'de (800 rpm) santrifüjleyin ° C Bir manyetik parçacık konsantratörü kullanan boncuk Reclaim. Süpernatantı atın. Dolgu için sonicated overhaNGS, T4 DNA polimeraz, 7 ul 10 mM dNTP ve 615,8 ul nükleaz ücretsiz su 70 ul 10 x Tampon ile bir master-mix hazırlayın. İyice karıştırın ve master-karışımı ile yıkanmış boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin. 7.2 ul 9.7 U / 700 ul nihai hacim için mikrolitre T4 DNA polimeraz ekleyin. 37 karıştırın ve 40 dakika boyunca inkübe ° rotasyon ile C (u = 60 Palico Biotech Intelli-Mikser RM-2L, F8, 30 rpm, U = 50, kullanarak). Aşağıdaki adımları izleyen tüm enzimatik reaksiyonları gerçekleştirin. Nükleaz ücretsiz su ile reaksiyona tamponlar seyreltin. Sulandırılmış tampon diğer tüm reaktifler (enzimler hariç) ekleyin. İyice karıştırın. Reaksiyon karışımı ile boncuk / pelletini tekrar. Süspanse boncuk / pelet (maksimum enzim aktivitesi sağlamak için her zaman benchtop soğutucu kutusu enzimler tutun) enzim ekleyin. Parafilm ile tüp mühürleyin. Boncuk tüm incubatio boyunca iyi karışık olduğundan emin olunn. Reaksiyon karışımı, atın ve buz gibi soğuk yıkama tamponu ile (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl) ile üç kere uzakta kalan tampon tuzları ve enzimler yıkayın. 2. ChIP DNA biotinlenmiş Yarım Bağlayıcılar Ligasyonu Video bu bölüm Chia-PET yapımı ve spesifik olmayan ve spesifik bağlanması ürünleri (13:28-14:24) arasında ayrım yapmak nükleotid barkod bileşimin kullanımını kullanılan yarı-bağlayıcı oligonükleotidler özelliklerini belirtmektedir video). bölümde aynı zamanda bir yarı-linker ligasyon reaksiyonu (Adım 2.2, videonun 14:24-15:54) kurma adım adım bir yordam gösterir. Biotinlenmiş yarım linkers iki tür bu protokolü tanıtıldı ve dört nükleotid (TAAG veya ATGT) dahili barkod ve tipi IIS restriksiyon enzimi MmeI (TCCAAC) için bir tanıma site ile tasarlanmıştır. ChIP zenginleştirmek sonrament, kromatin parçaları iki kısım halinde eşit olması sonike ve birinci yarı-bağlayıcı A ya da yarı-linker ya da B 5,9 fazlası ile ligate edilir. Bir veya yarım linkers B sırasıyla biotinlenmiş yarım hoşlanmayanlar tarafından DNA'nın yarım linker ligasyonu için iki alikotları içine ChIP-zenginleştirilmiş boncuk bölün. Nükleotid barkodlar olarak; Bu iki yarım bağlayıcılar (ATGT ile yarı-linker B yarı-linker ile bir TAAG) hizmet ortasında dört nükleotidin haricinde, aynı nükleotid sekanslar vardır. Iki farklı ChIP kompleksler arasındaki yakınlığı ligasyonu, rastgele ve non-spesifik ligasyonu sırasında kombine edildiğinde heterodimeri AB bağlayıcılar ile dizilerinin nüfus tespit edilebilir gibi homodimer AA veya BB bağlayıcılar ile dizilerinin nüfus tespit edilebilir belirli ligasyonu ile karşılaştırıldığında . PEG ile 140 ul 5 x T4 DNA ligaz tamponu ile Arter ChIP-zenginleştirilmiş boncuklar, 3.5 ul 200 ul / ng biotinlenmiş yarım linkers A veya B, 553,5 ul nükleazücretsiz su ve 3 ul 30 U / ul T4 DNA ligaz (ligaz bile buz üzerinde kararsız olduğu her zaman bir benchtop soğutucu kutusu T4 DNA ligaz tutun). Parafilm ile tüp Mühür ve 16 gece inkübe ° C rotasyon ile. 3. Elüsyon ve ChIP DNA Fragments Yakınlık Ligasyonu Video Bu bölümde boncuklar kromatin komplekslerinin elüsyon sırasında Tampon EB, SDS ve Triton X-100 rolünü açıklar ve ayrıca bir Sirkülasyon reaksiyon (Adım 3.9, 15:54 kadar ayarlama adım adım bir yordam gösterir video 17:10). Kromatin parçaları için yarı-bağlayıcı ligating sonra, her iki fraksiyonlar bir araya getirilmiş ve boncuk kapalı elüt edilmiştir. Etkileşim DNA fragmanları sonra yakınlık ligasyon sırasında tam bir linker dizisi tarafından bağlanır. Nükleotid barkod bileşimi kullanarak, dizileri üç kategoriye ayrılabilir, yani wi dizileriinci heterodimeri AB bağlayıcılar (barkod ATGT / TAAG) ve homodimer AA veya sırasıyla 9 non-spesifik ve spesifik ligasyon ürünleri ayırt etmek BB bağlayıcılar (barkod TAAG / TAAG veya ATGT / ATGT) ile dizileri. Bu nedenle, farklı nükleotid barkod ile iki yarım linkers kullanımı farklı deneyler belirtimi verir veya çoğaltır, aynı zamanda farklı ChIP kompleksleri 5 arası non-spesifik kimerik ligasyonu hızının takibi gibi. Buz gibi soğuk yıkama tamponu (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl) ile üç kez yarı-linker-bağlanan boncuklar yıkayın. Aşağıdaki şekilde yarı-linker-bağlanan boncuklar iki tüp birleştirin. Bir manyetik parçacık konsantratör kullanılarak yarı-linker-bağlanan boncuklar tüplerin biri ("Tüp A") geri. Buz üzerinde yarım ilintileyiciniz bağlanan boncuklar ("Tüp B") ve diğer boru tutun. (Adım 3.2.1 'dan itibaren) Tampon yıkayın f atınrom Tüp A ve Tüp içine Tüp B yarım ilintileyiciniz bağlanan boncuklar (adım 3.2.2 'dan itibaren) aktarmak A A manyetik parçacık toplayıcı halen Tüp iken. Kalan yarım ilintileyiciniz bağlanan boncuklar toplamak ve yarı-linker-bağlanan boncuklar hem tüplerin düzgün birleştirilir sağlamak Tüp B 700 ul buz Yıkama Tamponu ekleyin. Tüp içine A. yıkama tamponu aktarın boş Tüp B. atın 70 ul 10 x T4 DNA ligaz tamponu (NEB), 616 ul nükleaz ücretsiz su ve 14 ul 10 U / T4 DNA polinükleotid kinaz ul ile fosforile yarım ilintileyiciniz bağlanan boncuklar. Rotasyon ile 37 ° C 'de 50 dakika süreyle inkübe edin. Bir manyetik parçacık konsantratörü kullanan fosforile yarım ilintileyiciniz bağlanan boncuklar Reclaim ve reaksiyon karışımı atın. 200 ul taze hazırlanmış Elüsyon Tampon (TE Tampon,% 1 SDS) ile yarım ilintileyiciniz bağlanan kromatin-DNA kompleksi Zehir. (Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 22 ° inkübeC) rotasyon ile. Taze bir tüp eluat aktarın ve 900 ul Tampon EB boncuk yıkayın. Elutions birleştirmek aynı tüpe supernatant aktarın. Oda sıcaklığında 1 saat (22 ° C) için 16.110 x g (13200 rpm) ile iki santrifüj tüpüne filtre ve santrifüj filtre ile toplanan elüsyon bardak aktarın. 90 ul% 20 Triton X-100 ekleyerek SDS tecrit ve iyice karıştırın tersine çevirin. 37 de 1 saat inkübe ° C. Sirkülasyon istenmeyen kimerik DNA molekülü ortaya çıkmasına neden olur ve farklı kromatin kompleksleri arasında ligasyon olaylar en aza indirirken, bireysel çapraz-bağlanmış kromatin kompleksleri içindeki ligasyon etkinlik tercih bakımından son derece seyreltilmiş koşullar altında gerçekleştirilir. Buz üzerinde çalışan bir 50 ml Falcon tüp ile su verilmiş arındırıldı ve aktarmak ve 7776 ul nükleaz içermeyen su, 1000 ul 10 x T4 DNA Ligaz Tamponu (NEB) ile 33.33 ul 30 U / ml 'T4 DNA ligaz ekleyin. 16 gecede inkübe° C. 4. Ters-Crosslinking ve DNA Saflaştırma Adım 4.4 'de santrifüj sonrası pelet DNA kloroform ekstraksiyonu (Adım 4.3, 17:11-17:59) ve close-up: video Bu bölüm fenol adım adım bir yordam gösterir. Ters-çapraz bağ ve 100 ul 20 mg / ml proteinaz K solüsyonu ilave edilerek düşmesine proteini. 50 ° C'de 2 saat inkübe 50 ml'lik bir MaXtract Yüksek Yoğunluklu içine kromatin DNA transferi ve 19 ml 'lik bir nihai hacim elde etmek için 9ml nükleaz içermeyen su ilave edilir. Kimyasal bir davlumbaz tüp 19 ml 25:24:1 Fenol-Kloroform-İzoamil Alkol pH 7.9 ekleyin ve iyice karıştırın tersine çevirin. Oda sıcaklığında 1,800 x g'de (3000 rpm) ile 5 dakika için tüpler Spin. 1.9 ml 3 M sodyum asetat pH 5.5, 19 ml isopropan ile bir 50 ml Oak Ridge Santrifüj tüpleri (Teflon FEP) ve çökelti kromatin DNA ile üst sulu faz aktarmaol ve 5 ul Glycoblue. Glycoblue pelet görünürlüğü artırmak için ilave edilir. En az bir saat için -80 ° C'de inkübe edin. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 38,720 x g'de (18,000 rpm) santrifüje tabi önce erimeye sahip donmuş çözelti Izopropanol çökeltilmiş DNA Santrifüjlemeden sonra, 34 ul tampon içinde EB iki kere% 75 buz soğukluğundaki etanol ile yıkama ve DNA pelet tekrar süspansiyon DNA pelet. 1.7 ml DNA LoBind tüpüne DNA karışımı aktarın. 34 ul Tampon EB süspanse DNA pelet. (Sonraki yıkama ve Chia-PET protokolünde saflaştırma adımları olarak RNA ve bizim in-house kütüphanelerden Chia-PET dizileri manuel denetimler RNA kirlenmesine neden hiçbir iz göstermiştir kirlenmesine neden kaldırmak için hizmet RNaz tedavi isteğe bağlıdır). 10 ul RNaz TEK 10 x Reaksiyon Tamponu, 55 ul nükleaz ücretsiz su ve 1 ul 10 U / ul RNaz TEK Ribonükleaz ekleyerek RNaz sindirim gerçekleştirin. 37 inkübeBir saat için ° C. 2 ml MaXtract Yüksek Yoğunluklu içine kromatin DNA aktarın. Kimyasal bir davlumbaz tüp 100 ul 25:24:1 Fenol-Kloroform-İzoamil Alkol pH 7.9 ekleyin ve iyice karıştırın tersine çevirin. Oda sıcaklığında (22 ° C), 16.110 x g'de (13200 rpm) ile 5 dakika için tüp Spin. Yeni bir tüp ve 10 ul 3 M sodyum asetat pH 5.5 ve 100 ul izopropanol ile Çökelti ters-çapraz bağlı DNA ile üst sulu faz transfer edin. 4 ° C'de 16.110 x g (13200 rpm) ile 30 dakika için 30 dakika süre ile pellet DNA için -80 ° C sıcaklıkta inkübe Izopropanol çökeltilmiş DNA Santrifüjlemeden sonra, 34 ul tampon içinde EB iki kere% 75 buz soğukluğundaki etanol ile yıkama ve DNA pelet tekrar süspansiyon DNA pelet. 5. Streptavidin Beads Chia-PET DNA immobilizasyonu Varlığı hakkında bu bölümde görüşmelerin tanıtımıMmeI tanıma site ve etiket-linker-tag yapıları ("PET", video 18:02-19:10) çıkarılması kolaylaştırmak için yarım linker oligonükleotidler mevcut biotinlenmiş T. Buna ek olarak, video Bu bölümde ayrıca Adım 5.2, PCR reaksiyonu (Adım 6.1, videonun 19:10-20:00) kurmak ve başarılı bir eksize bir adım-adım prosedürü hızlı bir genel görünüm verir Chia-PET DNA (Adım 6.9, akflam 20:00 20:30). Yarım linkers A ve B bu tip IIS restriksiyon enzimi eşleştirilmiş tag-linker-tag yapıları üreten, kromatin fragmanının kısa "etiketleri" oluşturmak için aşağı hedef bağlayıcı siteleri 18/20 baz çifti kesmek için izin MmeI tanıma bölgelerini kuşatan içerir ("PET"). Chia-PET yapıları yakalama ve saflaştırılması izin streptavidin kaplı manyetik boncuk, yarı-linker A ve B de biotin ile modifiye ile PET yapıları saflaştırma etkinleştirmek için. Yayın c5 ul 10 ekleyerek aptured Chia-PET DNA taze 500 uM (10 x) S-adenosylmethionine (SAM) ve 1 ul 2 U / yeniden süspanse DNA ile ul MmeI hazırlanmış x NEBuffer 4, 5 ul. MmeI için reaksiyon karışımına 5 ul biyotinile olmayan yarı-linkerler eklenerek fazla MmeI Quench fazla öz inhibitör olabilir. 37 de 2 saat inkübe ° C. DNA LoBind tüp yeniden süspanse M-280 streptavidin boncuk yayımlanan Chia-PET DNA transferi 50μl yakalamak için. 2 x Ciltleme ve (: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl 2 x B & W) Tampon Yıkama iki kez boncuk yıkayın. 50 ul 2 x B & W Tampon içinde süspanse boncuk ve aynı tüp sindirim karışımı 50 ul (adım 5.1) aktarın. İyice karıştırın ve rotasyonu ile oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Bir manyetik parçacık konsantratörü kullanan boncuk Reclaim ve supernatant atın. 150 ul 1 x Ciltleme ve (: 5 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl 1 x B & W) Tampon Yıkama iki kez boncuk yıkayın. <li5 ul 10 x t4 dna ligaz tamponu (bu basamakta kullanılan adım 3,9 farklı olduğuna dikkat ediniz ile chia-pet> 454 Arter GS20 Adaptörler, bu basamakta kullanılan Ligaz Tamponu ki bu da aynı şirketten olduğu T4 DNA ligaz), 4 ul 200 ul / ng 454 GS20 Adaptör A, 4 ul 200 ul / ng 454 GS20 Adaptör B, 36 ul nükleaz ücretsiz su ve 1 ul 30 U / ul T4 DNA ligaz besler. Rotasyon ile 16 ° C'de gece boyunca inkübe edin. Chia-PET DNA da biz Illumina satın PCR primer PE1.0 ve PCR primer PE 2.0 kullanarak kitaplığı amplifikasyonu tavsiye bu durumda, Illumina-NN adaptörleri ile bağlandı edilebilir. Bir manyetik parçacık konsantratörü kullanan boncuk Reclaim ve supernatant atın. 150 ul 1 x B & W Buffer ile üç kez boncuk yıkayın. 5 ul 10 Nick tercüme Chia-PET DNA x NEBuffer 2, 2.5 ul 10 mM dNTP, 38.5 ul nükleaz ücretsiz su ve 4 ul 10 U / ul Escherichia coli DNA Polimeraz I. gecede inküberotasyon ile oda sıcaklığı (22 ° C). Bir manyetik parçacık konsantratörü kullanan boncuk Reclaim ve supernatant atın. 150 ul 1 x B & W Buffer ile üç kez boncuk yıkayın. 50 ul Tampon EB boncuklar tekrar. 6. Chia-PET DNA Amplifikasyon 2 ul boncuk süspansiyonu ile PCR reaksiyonları, 21 ul nükleaz ücretsiz su, 1 ul 10 uM Illumina 1-454 astar, 1 ul 10 uM Illumina 2-454 astar ve 25 ul Phusion High Fidelity Master Mix ayarlayın. , Sıralama için yeterli PCR ürünleri üretmek için gerekli devir sayısını belirlemek 16, 18 ve 20 döngüleri ile üç test PCR reaksiyonları kurmak. Hazır Biz çok düşük kütüphane karmaşıklığı yüzden sonuç yaparken bulduk gibi 20 döngü aşmayın. İlk Adım 30 saniye 98 ° C (Denatürasyon) 18 ila 25 devir 10 saniye 98 ° C (Denatürasyon) 30 saniye 65 ° C (Tavlama) 30 saniye 72 ° C (Uzatma) Son Adım 5 dakika 72 ° C (Son uzatma) Chia-PET DNA uzunluğu 223 baz çifti, bir grubun varlığını sağlamak, SYBR Green I ile% 4-20 degrade TBE jel ve boyanma PCR reaksiyonları çalıştırarak olası en düşük döngü sayısını belirler. Yine sekanslama için yeterli bir verim elde mümkün olduğunca az PCR döngüsüyle gibi olan büyük ölçekli bir PCR içinde Chia-PET DNA-bağlı streptavidin boncuk kalan yükseltin. Reİki taze DNA LoBind tüpler süpernatantı bir manyetik parçacık konsantratör ve havuzu kullanarak tüm PCR reaksiyonundan iddia boncuk. 60 ul 3 M sodyum asetat, 2 ul GlycoBlue ve havuzlanmış reaksiyonları için izopropanol 600 ul ilave edilerek süpernatan her bir tüp hızlandırabilir. 30 dakika boyunca -80 ° C'de inkübe edin. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 16.110 x g'de (13200 rpm) santrifüje 100 ul TE tamponu ve 5 ul 6 x loading boyası% 75 buz iki etanol ve tekrar süspansiyon DNA pelet ile izopropanol çökelen DNA, yıkama DNA pelet santrifüj sonra. Eşit bir% 6 TBE jel kuyulara PCR ürünleri dağıtın. 35 dakika için 200 V 1 x TBE tamponu içinde jel çalıştırın ve SYBR Green I. Koyu Okuyucu transilluminator ile jel görselleştirin ile leke. Dikkatle tüketim 223 bp jelden band ve aşağıdaki gibi "jel ezmek" DNA ekstraksiyon protokolü uygulayın: 0,6 ml MicroC eksize jel parçaları yerleştirin21-G iğne ile alt deldi oylandı entrifuge tüpler. 4 ° C'de 5 dakika için 16.110 x g (13200 rpm) bir 1.5 ml'lik vida kapaklı ve tüp içindeki her bir santrifüj tüpü yerleştirin Her tüp, 200 ul TE tamponu, pH 8.0 ilave edin ve jel parçaları tam olarak tampon daldırılır sağlar. 37 ° C'da bir saat için inkübe ve -80 ° C'de dondur. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.110 x g'de (13200 rpm) bir santrifüj tüpüne filtre ve santrifüj filtre kabına her bir tüp içinde tampon ile birlikte jel parçaları aktarma 200 ul TE tamponu, pH 8.0 ve birinci sıkma işlemi tamamlandıktan sonra her bir filtre ünitesine transfer durulama tampon ile her biri 1.5 ml tüp yıkayın. Havuz isopropanol ile filtre yoluyla ve çökelti. 15 ul TE tamponu ile süspanse DNA pelet. 7. Kalite, bir kontrolChia-PET DNA d Amplifikasyon Agilent DNA 1000 Tahlili ya da Agilent Bioanalyzer 2100 Agilent Yüksek Hassasiyet DNA Testi kullanılarak kalite kontrol ile devam edin. Agilent DNA testinin elektroferogram Illumina Genom Analyzer IIx sıralamaya geçmeden önce düz bir taban ile birlikte tek bir pik göstermesi gerekir. Illumina Genom Analyzer IIx sıralama öncesinde, Chia-PET DNA ideal 10 nM minimum konsantrasyon olmalıdır. Akış hücresi üzerine yüklemek için numune miktarını belirlemek için Illumina qPCR Niceleme Protokolü Rehberine göre 4 puanlık kantitatif PCR gerçekleştirin. Alternatif olarak, aşağıdaki gibi bir tek-noktalı kantitatif PCR işlemi gerçekleştirmek: 100 pM, 22:00 ve 01:00 için kontrol şablonu sulandırınız. Gibi Illumina qPCR Niceleme Protokol'de tanımlanan, bir denetim şablon Illumina platformu üzerinde sıralama için hazırlanmış herhangi bir kütüphane olarak tanımlanır ve bu bakımından mümkün olduğunca benzer olmalıdırşablon boyutu, GC içeriği ve kütüphane türü. Chia-PET DNA 22:00 için seyreltin. PCR Roche Uygulamalı Bilimler LightCycler 480 Real-Time ile 0.1 ul qPCR Primer 1.1, 0.1 ul qPCR Primer 2.1, 5 ul LightCycler480 DNA SYBR Green I Master Mix, 3.8 ul nükleaz ücretsiz su ve şablon 1 ul her seyreltme üç kez ayarlama PCR Sistemi. Şablon olarak nükleaz ücretsiz su 1 ul kullanarak iki negatif kontrolleri ekleyin. İlk Denatürasyon 95 ° C'de 5 dakikada 4.8 ° C / s Amplifikasyon 95 ° C'de 10 saniye 4.8 ° C / s 60 ° C'de 1 dakika ile 2.5 ° C / s 72 ° C'de 30 saniye 4.8 ° C/ S Erime Eğrisi 95 ° C de 5 saniye 4.8 ° C / s 65 ° C 1 dakika ile 2.5 ° C / s ° C başına 95 ° C de 5 satın Soğutma 40 ° C'de 10 saniyede 2.0 ° C / s Negatif kontroller amplifikasyon göstermek emin olun ve Ct değerleri için standart sapma denetimi şablon seyreltmeler oluşturulan standart eğri dayalı kitaplık şablonları konsantrasyonu hesaplamadan önce 0,1 daha az olduğunu. 13:05 int yükleme ile Illumina akış hücrelerin yüzeyi üzerinde kümeleri oluşturmakEkrandaki talimatlara göre o Illumina CBOT Küme Üretim Sistemi. Kütüphanenin kalitesini görmek için tek bir şeritte Illumina 3-454 sekanslama astar ve Illumina 4-454 sekanslama astar kullanılarak Illumina Genom Analyzer IIx sekansını Chia-PET DNA geçin. -20 ° C'de kalan Chia-PET DNA Mağaza Kitaplık iyi bir veri varsa, gibi 18-20000000 benzersiz okuma elde etmek için numune şeritli sonuçlarına göre gerekli 4 ila 8 şeritli ek tiraj için örnek hazırlamaktır. Akış hücreleri üzerine yüklenen Chia-PET DNA miktarı dizileme veri analiz yazılımı, Illumina Ardışık Kontrol Studio sürümüne büyük ölçüde bağlıdır. Sürüm 2.9 için, üçte biri filtrelenen yaklaşık 21 milyon geçiş eşittir her kiremit, maksimum kapasitesinin yarısı kadar yükleme konsantrasyon aralıkları yaklaşık 9,5 milyon Evcil okur ile okur. Azaltılmış yükleme doğru baz görüşme f sağlamak için gerekliveya linkers barkod dizileri. Bu, hata linker dizisi ise, benzer nükleotid sayısının yüksek sıralı zaman, barkod gibi bilgileri elde etmek için, olduğu gibi gerçekleşir. Barkodlama bilgilerin istenmediği ve linkers sonra tam yükleme konsantrasyonda kullanılır, okumak değilseniz. Çevrimdışı tabanı arayan tarafından dönüştürülen qSeq dosyalarını daha Chia-PET Aracı kurulum kılavuzu (Versiyon 4.1) 8 uyarınca Chia-PET aracı kullanılarak analiz edilebilir. C. Örnek Chia-PET Sonuçlar Başarıyla yukarıda tarif edildiği gibi ChIP malzeme 672 ng kullanılarak MCF-7 hücreleri (CHM160 ve CHM163) 9, RNA polimeraz II antikor (8WG16) kullanılarak Chia-PET kütüphaneleri oluşturulmuştur. Ilk tanı jel gibi Chia-PET protokol Adım 6.2 'de belirtildiği gibi, bu PCR-güçlendirilmiş kütüphane çalışacak bir aydınlık ve iyi tanımlanmış bant görüntülenir(bkz. Şekil 4) Kullanılan tüm PCR bisiklet için 223 baz çiftlerinin beklenen boyutu. 16. PCR döngüsüyle Chia-PET kütüphane amplifiye etmek için kullanıldı ve 17.1 ng toplam verim elde edilmiştir. Chia-PET protokolü (bkz. Şekil 5) Adım 7.1 belirtildiği gibi tek bir yoğun elektroferogram pik Agilent DNA 1000 analizi ile 223 baz çiftlerinin beklenen boyutta gözlendi. Şekil 1. ChIP bakış. MCF-7 hücreleri mekansal olarak bitişik kromatin arasında kovalent bağlantıları ile sonuçlanan sıralı EthylGlycol bis (SuccinimidylSuccinate (EGS) ve formaldehid ile çapraz bağlanmış çift bulunmaktadır. Çapraz-bağlanmış kromatin hücre parçalama yoluyla sabit MCF-7 hücreleri elde edilmiştir ve nükleer lizis. kromatin sonra 200-600 baz çifti bir boyut aralığı için parçalanma tabi tutuldu. Protei ile sonicated kromatin önceden temizledikten sonraNon-spesifik DNA kaldırmak için n G manyetik boncuklar, önceden temizlenmiş kromatin ilgi kromatin yakalamak için antikor kaplı boncuklar ile gece boyunca immunoprecipitated edildi. Şekil 2. Sonicated kromatin parçaları Jel analizi. A 100 bp DNA ladder boyutu başvuru için ilk ve son şeritte gösterilir. Sonicated kromatin uzun menzilli kromatin etkileşimleri yakalamak için idealdir 200 ila 600 bp arasında güçlü yoğunluğu görüntülenir. Şekil 3,. Chia-PET bakış. Parçalanmış kromatin fragmanlarını uç-geri püskürttü ve sınırdaş MmeI sınırlandırma bölgelerini içeren biotinlenmiş yarım linkers için bağlandı vardır. Bozulmamış kromatin etkileşim kompleksleri sonra DNA fragmanları pref öyle ki, son derece seyreltilmiş koşullar altında kapalı boncuklar elüt yakınlık ve ligasyon tabi tutulurerentially birbirlerine bağlandı. Ters sonra, DNA-ilişkili proteinleri uzaklaştırmak için, çapraz-bağlama, MmeI sindirim ardından streptavidin boncuklar için seçici bağlayıcı saflaştınlır etiket-linker-tag (PET) oluşturur, serbest bırakmak için yapılır. PET yapıları high-throughput sekanslama için adaptörler ligate edilir. Şekil 4. PCR amplifikasyon sonrası Chia-evcil hayvanların jel analizi. Bir 25 bp DNA merdiven boyut referans için şerit 1 ve 5 'de gösterilmiştir. 2-4 şerit sırasıyla boncuk-hareketsizleştirilmiş şablonun 2 ul, ikinci PCR 16 sonra üretilen ürünler, 18 ve PCR 20 döngü vardır. Bu gibi 223 bp beklenen boyutunda parlak, iyi tanımlanmış bantlar ile gösterilen başarılı bir kitaplıktır. Her bir PCR reaksiyonu, en düşük bant astar dimerleri oluşur sırasında PCR döngü sayısı arttırıldığı zaman özgül olmayan yayma oluşturulur. <img src= "Alt" > Şekil 5,. 223 bp beklenen boyutta tek bir yoğun zirve ile, başarılı bir kütüphane profilleme Agilent 2100 Bioanalyzer electropherograms arasında Illumina-454 adaptör bağlandı Chia-PET. Ekran yakalama saflaştırılmış Agilent 2100 Bioanalyzer analizi. Agilent Bioanalyzer tahlil genellikle biraz daha yüksek-daha-beklenen boyutu raporları olduğunu unutmayın, bu durumda, istenen tepe yerine 223 bp 237 bp görüntülenir. Bu Agilent testinin% 10 hata aralığı içindedir.