Хроматина анализ взаимодействия с парными-End тегов секвенирования (Chia-ПЭТ) для карт хроматина Взаимодействие и понимание регуляции транскрипции

А. Хроматин иммунопреципитации (чип) (см. Рисунок 1) 1. Двойной Сшивание хроматина, связанных белков и клеточных уборки (В 2:10 по видео) Хроматин иммунопреципитации (чип) является первым важным шагом, участвующих в построении Чиа-ПЭТ библиотеки. Этот шаг важен для снижения уровня сложности, фоновый шум и добавить специфику. Подготовка чипа должны быть оптимизированы для типа клеток и факторов, представляющих интерес. Этот протокол основан на РНК-полимеразы II Чиа-ПЭТ библиотеки готовят из MCF-7 клеток 9 построены в нашей лаборатории. Чтобы убедиться, что полученная библиотека достаточной сложности, мы рекомендуем использовать 1 х 10 8 клеток для подготовки стружки. В зависимости от линии цели и клетки, выход может быть получена от 100 нг до 300 нг. Мы рекомендуем, как минимум, 100 нг чип должен быть использован для совместногоnstruct Чиа-ПЭТ библиотека менее 20 циклов ПЦР, чтобы минимизировать избыточность в последовательности. Высшее количество стружки позволит дальнейшее сокращение избыточности, повышения качества библиотеки. Промыть 1 х 10 8 MCF-7 клеток (что эквивалентно пяти 500 см 2 квадратных пластин 2 х 10 7 клеток) в два раза фосфатным буферным солевым раствором (PBS), предварительно нагревают при 37 ° C. Crosslink MCF-7 клеток с 1,5 мМ свежеприготовленный EthylGlycol бис (SuccinimidylSuccinate) (ЭТУ)) в течение 45 минут при комнатной температуре (22 ° C) с вращением в химической вытяжкой. Добавить 37% формальдегида до конечной концентрации 1% в течение 20 минут при комнатной температуре (22 ° C) с вращением в химической вытяжкой. Утолить сшиватели, добавляя 2 М глицин до конечной концентрации 200 мм. Инкубировать 10 минут при комнатной температуре(22 ° C) с вращением. Отменить закаленных сшиватели в отходы колбы и промыть клетки в два раза с холодным PBS. Отменить PBS и урожай клеток путем соскоба. Хранить собранных клеток на льду. Промыть пластины с 5 мл PBS (с Ингибиторы протеазы ("+ PI") добавлена ​​в соответствии с инструкциями производителя) максимально сбор клеток. Гранул клеток при 1800 мкг (3000 оборотов в минуту) в течение 10 минут при 4 ° C. Удалить супернатант и приступить к лизису клетки. Кроме того, хранить гранулы при температуре -80 ° C. 2. Лизиса клеток (В 4:15 по видео) Ресуспендируют осадок в 15 мл 0,1% SDS лизис буфера (50 мМ HEPES pH7.5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон Х-100, 0,1% натрия Deoxycholate, 0,1% SDS + PI) тщательно с помощью пипетки. Поворот на 15 минут при 4 ° C. Гранул лизируют клетки при 800 хг (2000 оборотов в минуту) в течение 10 минут при 4 ° C. Удалить супернатант и повторите лизиса клеток как раз в шаге 2.1 и 2.2. Изолированных ядерных гранул готова к ядерному лизиса. Кроме того, магазин гранулы при температуре -80 ° C. 3. Ядерная Лизис (В 05:00 по видео) Ядерная лизис осуществляется выпустить сшитый хроматина до фрагментации хроматина. В отсутствие ядерной мембраны, сшитый хроматина можно ультразвуком использованием мягких условиях. Иногда, ультразвуком силы не может быть достаточным, чтобы разрушить ядерные мембраны в этом случае меньше хроматина будут получены, потому что неповрежденные ядра будут потеряны после центрифугирования. Тем не менее, различные типы клеток может потребовать различных условиях. Ресуспендируйте изолированных ядрах гранул в 15 мл 1% SDS лизис буфера (50 мМ HEPES pH7.5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон Х-100, 0,1% натрия Deoxycholate, 1% SDS + PI). Передача ядер подвески высокоскоростные центрифуги трубы (Oak Ridge Центрифуги труб (полипропилен)) и поверните на 15 минут при 4 ° C. Лизированных гранул пеллет ядер в 47810 мкг (20000 оборотов в минуту) в течение 30 минут при 4 ° C. Переливать супернатант и разрыв гранул с P1000 кончиком пипетки. Вымойте гранул с 30 мл 0,1% SDS буфере для лизиса (+ PI). Поворот на 15 минут при 4 ° C. Гранул хроматина в 47810 мкг (20000 оборотов в минуту) в течение 30 минут при 4 ° C. Удалить супернатант и повторите мыться один раз в соответствии с шагом от 3,4 до 3,6, прежде чем приступить к фрагментации хроматина. Кроме того, магазин хроматина гранулы при температуре -80 ° C. 4. Фрагментации хроматина (В 7:03 по видео) Передача хроматина гранул на 14 мл трубку полистирола круглой тест вниз. Добавить 1 мл 0,1% SDS буфере для лизиса (+ PI) с хроматином рфиле. Убедитесь в отсутствии пузырьков в смеси, так как это влияет на эффективность обработки ультразвуком. Сдвиг хроматина ДНК размером от 200 до 600 пар оснований с Брэнсон цифровой Sonifer Сотовые Disrupter (амплитуда 35%, 9 минут (30 секунд, 30 секунд в выключенном состоянии)) и сохранить образцы холодного в любое время, чтобы предотвратить перегрев, выполнив ультразвука в холодном помещении (см. Рисунок 2). Обратный сшить аликвоту хроматина и фрагментация проверить эффективность с помощью следующих шагов. (Следующие шаги не будут показаны в видео). Алиготе 10 мкл хроматина после обработки ультразвуком. Центрифуга ультразвуком хроматина в 16 110 мкг (13 200 оборотов в минуту) в течение 5 минут при 4 ° C. Передача супернатант в новую пробирку и добавляют 2 мкл протеиназы K. Инкубировать 30 минут при 50 ° C. Разрешить обратное сшитый хроматина на 1,5% агарозном геле. Repeaт ультразвуком, если размеры ДНК больше, чем ожидалось. Центрифуга оставшихся лизата на 16 110 мкг (13 200 оборотов в минуту) в течение 30 минут при 4 ° C и передачи ультразвуком хроматина (супернатант) в новую трубу до preclearing с магнитных шариков. Кроме того, магазин ультразвуком хроматина при -80 ° C до достаточного хроматин собирается начать чип. 5. Стирка, Preclearing и покрытие Антитела к бисера (В 08:17 по видео) Preclearing хроматина Используйте 300 мкл магнитные шарики G белка для одного IP. Вымойте бисером трижды 5 мл промывочного буфера бисер (PBS, 0,1% Triton X-100). Это и будущие мойки с участием магнитных белка G бусин состоит из следующих шагов. Убедитесь, магнитные шарики не высохнут. Исправьте бусин с помощью магнитного концентратора частиц. Discard супернатант. Ресуспендируйте бисер с буфером. Поворот в течение 5 минут при 4 ° C. Центрифуга в 129 мкг (800 оборотов в минуту) в течение 1 минуты при температуре 4 ° C. Исправьте бусин с помощью магнитного концентратора частиц. Удалить супернатант. Комбинат ультразвуком хроматина с prewashed бисером, для удаления фона обязательного хроматина в бисер. Держите 10 мкл ультразвуком хроматина, как "вход" для последующей проверки обогащения количественной ПЦР (КПЦР). Хранить при температуре 4 ° C. Поворот на ночь при 4 ° C. Центрифуга ультразвуком хроматина в 129 мкг (800 оборотов в минуту) в течение 1 минуты при температуре 4 ° C. Положите трубку на магнитные частицы концентратора. Покрытие Антитела к магнитные шарики Алиготе 300 мкл магнитных шариков г белка на новую пробирку. Вымойте бисером трижды 5 мл буфера Wash бисер (PBS, 0,1% Triton X-100). Добавить эквивалентного объема (как шаг 5.1.3) из промывочного буфера бусы. Добавить 35 мкг РНК-полимеразы II (8WG16) моноклональных антител. Поворот на ночь при 4 ° C. Вымойте антителами бусин в два раза с 5 мл промывочного буфера бусы. Исправьте антителами бусин с помощью магнитного концентратора частиц. 6. Хроматин иммунопреципитации (В 10:03 по видео) Чтобы снизить уровень сложности и фонового шума, антитела против специфических факторов белка используются для обогащения определенных фрагментов хроматина интересов перед близостью перевязки 6. Здесь мы использовали мышь РНК-полимеразы II моноклональныхантитело (8WG16), которые признаны начала формы белка. По обогащения фрагменты ДНК, которые связаны с РНК-полимеразой II, специфика библиотека может быть увеличен, позволяющие идентифицировать дальнего хроматина взаимодействия между активными промоутерами и соответствующие регуляторные области 9. Отменить промывочный буфер с антителами бусин с помощью магнитного концентратора частиц. Передача ультразвуком хроматина (супернатант с шагом 5.1.6) с помощью магнитного концентратора частицы антителами шарики (с шагом 5.2.7). Поворот на ночь при 4 ° C. 7. Мытье и Элюирование Immunoprecipitated ДНК-белковых комплексов (В 11:13 по видео) Вымойте хроматина immunoprecipitated бисером раза с 5 мл 0,1% SDS буфера для лизиса. Вымойте бисером раза с 5 мл промывочного буфера высокая Соль (50 мМ HEPES рН 7,5, 350 мм NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон Х-100, 0,1% натрия Deoxycholate, 0,1% SDS). Вымойте бисером раза с 5 мл Хлорид лития промывочного буфера (10 мМ Трис рН 8,0, 250 мМ LiCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5% Nonidet Р-40, 0,5% натрия Deoxycholate). Отменить промывочный буфер и ресуспендируют промытый бусин с 1 мл буфера ТЕ. Поворот в течение 5 минут при 4 ° C. Образец готов для количественного и проверка ChIP обогащения. После достаточного количества материала чип был собран образец готов быть построен в Chia-ПЭТ библиотеки. Этот шаг важен, и нужно сделать, чтобы обеспечить успешное Чиа-ПЭТ библиотеки строительства. ChIP обогащенные гранулы могут храниться в течение 2 недель при температуре 4 ° С, а подвергается количественной, ChIP проверки обогащение и накопление достаточного количества материала. Элюции и обратной сшивки "вход" ДНК и чип-обогащенного бисером, выполнив следующие действия. (Следующие шаги не будут показаны в видео). Элюции 20% чип-обогащенного бисер с 200 мкл буфера элюирования чип (50 мМ Трис рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 1% SDS). Поворот на 30 минут при температуре 37 ° C. Центрифуга элюированных бисером при 6100 мкг (800 оборотов в минуту) в течение 1 минуты при температуре 4 ° C. Передача элюированных ChIP комплексов (супернатант) в новую пробирку с помощью магнитного концентратора частиц. Обратный сшивки "вход" и элюированных ChIP комплексов с 2 мкл протеиназы К (конечная концентрация 0,2 г / мл) в течение 2 часов при температуре 50 ° C. Передача обратного сшитый "вход" ДНК и ДНК элюированных чипа в 2 мл MaXtract высокой плотности (соответственно). Добавить 200 мкл 25:24:1 фенол-хлороформ-изоамилового спирта рН от 7,9 до труб в химической вытяжкой и перевернуть на хорошо перемешать. Вращайте трубы в течение 5 минут при 16110 х г (13 200 оборотов в минуту) при комнатной температуре. Передача верхней водной фазы в новую пробирку и ускорить обратный сшитого ДНК остроумиеч 20 мкл 3 М ацетата натрия рН 5,5, 200 мкл изопропанола и 1 мкл 15 мг / мл Glycoblue. Инкубировать при температуре -80 ° С в течение 30 минут и гранул ДНК в течение 30 минут при 16 110 мкг (13 200 оборотов в минуту) при 4 ° C. После центрифугирования изопропанола осажденного ДНК, ДНК мыть гранул с 75% ледяной этанола в два раза и ресуспендируют ДНК гранул в 20 мкл буфера ТЕ. Количественной "вход" ДНК (с шагом 5.1.3) и чип ДНК picogreen анализ 10. Выполните проверку по обогащению качественной ПЦР (КПЦР). B. Взаимодействие хроматина анализ с помощью парного тега-End секвенирования (Chia-PET) Во второй половине видео будут освещены основные этапы строительства Чиа-ПЭТ библиотеки. 1. Конечный притупление ChIP фрагменты ДНК В этой главе видео выделяет два мАйн точек, шаг за шагом процедуры стиральных магнитных шариков для удаления ферментов и буферные соли предыдущей реакции (шаг 1.1, 12:22 в 12:54 на видео) и порядок создания ферментативных реакций с участием магнитных шариков в реакционной смеси (шаг 1.2, 12:54 в 13:25 в видео). Вымойте ChIP обогащенного бисером раз с ледяной буфера TE. Это и будущие мойки с участием магнитных шариков состоит из следующих шагов. Центрифуга при 6100 мкг (800 оборотов в минуту) в течение 1 минуты при температуре 4 ° C. Исправьте бусин с помощью магнитного концентратора частиц. Удалить супернатант. Добавить буфер бисера. Смешайте бисер с буфером, щелкая действие. Центрифуга при 6100 мкг (800 оборотов в минуту) в течение 1 минуты при температуре 4 ° C. Исправьте бусин с помощью магнитного концентратора частиц. Удалить супернатант. Чтобы заполнить ультразвуком overhaNGS, подготовить мастер-микс с 70 мкл 10 х буфера для T4 ДНК-полимеразы, 7 мкл 10 мМ дНТФ и 615,8 мкл нуклеазы без воды. Тщательно промытые и ресуспендируют бусин с мастер-микс. Добавить 7,2 мкл 9,7 ед / мкл T4 ДНК-полимеразы до конечного объема 700 мкл. Смешать и инкубировать 40 минут при 37 ° C с вращением (с помощью Palico Biotech Intelli-Mixer RM-2L, F8, 30 мин, U = 50 и = 60). Выполнить все последующие ферментативные реакции с помощью следующих шагов. Развести реакции буферы с нуклеазы без воды. Добавить все остальные реагенты (кроме ферментов) в разбавленном буфере. Тщательно перемешайте. Ресуспендируйте бисером / гранул с реакционной смеси. Добавить фермент ресуспендировали бисером / гранулу (Keep ферментов на настольный кулер окна в любое время, чтобы обеспечить максимальную ферментативную активность). Печать трубки с парафильмом. Убедитесь, что шарики хорошо перемешиваются по всей incubatioл. Отменить реакционной смеси и смыть остаточных солей и ферментов буфер трижды с ледяной промывочного буфера (10 мМ Трис-Cl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 500 мМ NaCl). 2. Лигирование Биотинилированные Half-линкеры к чипу ДНК В этой главе видео характеристики половине компоновщик олигонуклеотиды, используемые в строительстве Чиа-ПЭТ и использования штрих-кодов нуклеотидного состава различать неспецифические и специфические перевязки продуктов (13:28 по 14:24) в видео). В этой главе также показано шаг за шагом процедуры создания половине компоновщик реакции лигирования (шаг 2.2, 14:24 в 15:54 в видео). Два типа биотинилированного половины линкеры вводятся в протокол и разработаны с внутренним штрих-кода из четырех нуклеотидов (TAAG или ATGT) и сайт узнавания для типа IIS рестрикции MmeI (TCCAAC). После обогащения ChIPМент, ультразвуком хроматина фрагменты делятся поровну на две порции и сначала лигировали с избытком или полу-компоновщика или полу-компоновщик B 5,9. Разделите ChIP обогащенного бисера на две порции ДНК половины компоновщик лигирование биотинилированного половины линкеров или полу-линкеров B соответственно. Эти две половины линкеры те же нуклеотидные последовательности, за исключением четырех нуклеотидов в центре, которые служат (Half-компоновщик с TAAG, половина-компоновщик B с ATGT) в нуклеотидной штрих-кодов. При сочетании в непосредственной близости труб, случайные и неспецифические перевязку между двумя различными комплексами чип может быть идентифицирован с населением последовательностей с гетеродимер линкеры AB, по сравнению с конкретным перевязку, которые могут быть идентифицированы с населением последовательностей с гомодимер АА или ВВ линкеров . Перевязывать ChIP обогащенного бусин со 140 мкл 5 х буфера T4 ДНК-лигазы с PEG, 3,5 мкл 200 нг / мкл биотинилированного половины линкеры А или В, 553,5 мкл нуклеазы-свободной воды и 3 мкл 30 ед / мкл T4 ДНК-лигазы (Keep T4 ДНК-лигазы на поле настольного кулера во все времена, как лигазы неустойчивы даже на льду). Печать трубки с парафильмом и инкубировать в течение ночи при 16 ° C с вращением. 3. Элюции и близость Лигирование ChIP фрагменты ДНК В этой главе видео объясняет роль буфера Е.Б., SDS и Triton X-100 во время элюирования хроматина комплексов из бисера, а также показывает, шаг за шагом процедуры создания рассылке реакции (шаг 3.9, в 15:54 17:10 на видео). После лигирования половине линкеров к хроматина фрагменты, обе фракции объединяются и элюировали бисера. Взаимодействие фрагмента ДНК, затем будет связан полный компоновщик последовательности во время близости труб. Использование штрих-кода нуклеотидов, последовательность можно разделить на три категории, а именно последовательностей шм гетеродимер AB линкеры (штрих-кода ATGT / TAAG) и последовательности с гомодимер АА или ВВ линкеры (штрих-кода TAAG / TAAG или ATGT / ATGT), чтобы отличить неспецифические и специфические продукты лигирования соответственно 9. Таким образом, использование двух полу-линкеры с разными штрих-кодов позволяет нуклеотидной спецификации различных экспериментов или репликации, а также для контроля неспецифического химерных скорость перевязки между различными комплексами ChIP 5. Промыть 1/2-линкер-перевязанной бисером трижды с ледяной промывочного буфера (10 мМ Трис-Cl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 500 мМ NaCl). Комбинат обе трубки половины-линкер-перевязанной бусины следующим образом. Освободите одну из труб 1/2-линкер-перевязанной бисер с помощью магнитного концентратора частиц ("Труба"). Держите другую трубу половину-линкер-перевязанной бисером на льду ("труба B"). Отменить промывочного буфера (из шага 3.2.1) Пром трубы и передать половину компоновщика перевязанной шарики (с шага 3.2.2) из ​​труб B в трубы в то время как труба остается на магнитном коллектор частиц. Добавить 700 мкл ледяной промывочного буфера для труб B для сбора остаточного половины компоновщика перевязанной бисером и обеспечить как трубы половину компоновщика перевязанной бисера в сочетании правильно. Передача буфера для промывки труб в А. выбросить пустые трубы B. Фосфорилировать половины компоновщика перевязанной бисером с 70 мкл 10 х T4 ДНК-лигазы буфера (НЭБ), 616 мкл нуклеазы без воды и 14 мкл 10 ед / мкл Т4 полинуклеотидных ДНК. Инкубировать 50 минут при 37 ° C с вращением. Исправьте фосфорилированных половины компоновщика перевязанной бусин с помощью магнитного концентратора частиц и отказаться от реакционной смеси. Элюции половины компоновщика перевязанной хроматина ДНК-комплекса с 200 мкл свежеприготовленного элюции буфера (TE буфера, 1% SDS). Инкубировать 30 минут при комнатной температуре (22 °C) с вращением. Передача элюата в новую пробирку и промойте бисер с 900 мкл EB буфера. Передача супернатант к тому же трубы объединить elutions. Передача собранных элюата с фильтром из двух чашек центрифуге трубки фильтров и центрифуг на 16 110 мкг (13 200 оборотов в минуту) в течение 1 минуты при комнатной температуре (22 ° C). Секвестр SDS путем добавления 90 мкл 20% Triton X-100 и перевернуть, чтобы хорошо перемешать. Выдержите в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Рассылке осуществляется в чрезвычайно разбавленном условия для того, чтобы способствовать перевязки мероприятий в рамках отдельных сшитого комплексов хроматина при минимизации перевязки событий между различными комплексами хроматина которые приводят к нежелательным химерные молекулы ДНК. Работа на льду, передавать закаленных элюата на 50 мл трубку сокол и добавить 7776 мкл нуклеазы без воды, 1000 мкл 10 х T4 ДНК-лигазы буфера (НЭБ) и 33,33 мкл 30 ед / мкл T4 ДНК-лигазы. Инкубируйте ночь на 16° C. 4. Обратный Сшивание и очистки ДНК Эта глава показывает видео, шаг за шагом процедуры фенол: хлороформ (шаг 4.3, 17:11 в 17:59) и крупным планом гранулированный ДНК после центрифугирования в шаге 4.4. Обратный сшивания и деградации белка путем добавления 100 мкл 20 мг / мл протеиназы К решению. Выдержите в течение 2 часов при температуре 50 ° C. Передача хроматина ДНК в 50 мл MaXtract высокой плотности и добавить 9ml нуклеазы без воды, для получения конечного объема 19 мл. Добавить 19 мл 25:24:1 фенол-хлороформ-изоамилового спирта рН от 7,9 до трубы в химической вытяжкой и перевернуть, чтобы хорошо перемешать. Вращайте трубы в течение 5 минут при 1800 мкг (3000 оборотов в минуту) при комнатной температуре. Передача верхней водной фазы 50 мл Oak Ridge пробирок (Teflon FEP) и осадок хроматина ДНК с 1,9 мл 3 М ацетата натрия рН 5,5, 19 мл isopropanола и 5 мкл Glycoblue. Glycoblue добавляется для повышения видимости гранул. Инкубировать при температуре -80 ° C, по крайней мере час. Позвольте замороженных решение таять перед центрифугированием при 38720 мкг (18000 оборотов в минуту) в течение 30 минут при 4 ° C. После центрифугирования изопропанола осажденного ДНК, ДНК мыть гранул с 75% ледяной этанола в два раза и ресуспендируют ДНК гранул в 34 мкл буфера EB. Передача ДНК смеси 1,7 мл трубки LoBind ДНК. Ресуспендируйте ДНК гранул в 34 мкл буфера EB. (РНКазы лечение не является обязательным, как последующее мытье и очистка шаги в Chia-ПЭТ протокол служит для удаления загрязняющих РНК и руководства проверок Чиа-ПЭТ последовательностей из нашей собственной библиотеки проявили никаких следов заражения РНК). Выполните РНКазы пищеварения, добавив 10 мкл РНКазы ONE 10 х Реакция буфера, 55 мкл нуклеазы без воды и 1 мкл 10 ед / мкл РНКазы ONE рибонуклеазы. Инкубировать при температуре 37° C в течение часа. Передача хроматина ДНК в 2 мл MaXtract высокой плотности. Добавить 100 мкл 25:24:1 фенол-хлороформ-изоамилового спирта рН от 7,9 до трубы в химической вытяжкой и перевернуть, чтобы хорошо перемешать. Вращайте трубы в течение 5 минут при 16110 х г (13 200 оборотов в минуту) при комнатной температуре (22 ° C). Передача верхней водной фазы в новую пробирку и осадок обратной сшитого ДНК с 10 мкл 3 М ацетата натрия рН 5,5 и 100 мкл изопропанола. Инкубировать при температуре -80 ° С в течение 30 минут и гранул ДНК в течение 30 минут при 16 110 мкг (13 200 оборотов в минуту) при 4 ° C. После центрифугирования изопропанола осажденного ДНК, мыть ДНК гранул с 75% ледяной этанола в два раза и ресуспендируют ДНК гранул в 34 мкл буфера EB. 5. Иммобилизация Чиа-ПЭТ ДНК стрептавидином бисера Внедрение этой главе говорится о наличииучастка MmeI признание и биотинилированного T присутствует в половине компоновщик олигонуклеотидов для облегчения добычи тег-линкер-теги конструкции ("Домашние животные", 18:02 по 19:10 на видео). Кроме того, в этой главе видео и дает быстрый общий вид шаг 5.2, шаг за шагом процедуры создания ПЦР (шаг 6.1 19:10 до 20:00 на видео) и иссечения успешным Чиа-ПЭТ ДНК (шаг 6.9, с 20:00 до 20:30). Half-линкеров и B содержат фланговых участков MmeI признание, что позволило этим ограничением типа IIS фермент сократить 18/20 пар оснований вниз по течению от их целевого сайты связывания для генерации коротких "метки" на хроматин фрагмент, создавая парный тег-линкер-теги конструкций ("Домашние животные"). Для обеспечения очистки ПЭТ-конструкции на покрытых стрептавидином магнитных шариков, как полу-компоновщик и B изменяются с биотином, позволяющий захват и очистку Чиа-ПЭТ конструкций. Выпуска сaptured Чиа-ПЭТ ДНК, добавив 5 мкл 10 х NEBuffer 4, 5 мкл свежеприготовленного 500 мкМ (10 х), S-аденозилметионина (SAM) и 1 мкл 2 U / мкл MmeI в ресуспендированного ДНК. Угашайте избыток MmeI добавлением 5 мкл без биотинилированного половины линкеров в реакционную смесь для MmeI может быть самостоятельным тормозным в избытке. Выдержите в течение 2 часов при температуре 37 ° C. Для захвата выпустила Чиа-ПЭТ ДНК, передача 50 мкл ресуспендированного М-280 бусин стрептавидина к трубке LoBind ДНК. Вымойте бусин в два раза с 2-х Переплет и промывочного буфера (2 х B & W: 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 2 М NaCl). Ресуспендируйте бусины в 50 мкл 2 х B & W буфера и передать 50 мкл пищеварение смеси (с шагом 5.1) к той же трубе. Хорошо перемешайте и выдержите в течение 45 минут при комнатной температуре с вращением. Исправьте бусин с помощью магнитного концентратора частиц и отказаться от супернатант. Вымойте бусин в два раза с 150 мкл 1 х Переплет и промывочного буфера (1 х B & W: 5 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 0,5 мМ ЭДТА, 1 М NaCl). <li> Перевязывать 454 GS20 Адаптеры для Чиа-ПЭТ ДНК с 5 мкл 10 х T4 ДНК-лигазы буфера (Заметим, что лигазы буфер, используемый на этом этапе отличается от шага 3.9, лигазы буфера, используемые в данном шаге от той же компании, как то, что поставляет Т4 ДНК лигазы), 4 мкл 200 нг / мкл 454 GS20 адаптер, 4 мкл 200 нг / мкл 454 GS20 Адаптер B, 36 мкл нуклеазы без воды и 1 мкл 30 ед / мкл T4 ДНК-лигазы. Выдержите в течение ночи при 16 ° C с вращением. Чиа-ПЭТ ДНК также могут быть лигировали с Illumina-НН адаптеры, в этом случае мы рекомендуем усиления библиотеки с помощью ПЦР праймеров и ПЦР PE1.0 грунтовка PE 2.0 приобрести Illumina. Исправьте бусин с помощью магнитного концентратора частиц и отказаться от супернатант. Вымойте бисером трижды с 150 мкл 1 х B & W Buffer. Ник перевод Чиа-ПЭТ ДНК с 5 мкл 10 х NEBuffer 2, 2,5 мкл 10 мМ дНТФ, 38,5 мкл нуклеазы без воды и 4 мкл 10 ед / мкл кишечная палочка ДНК-полимеразы I. инкубировать в течение ночи прикомнатной температуре (22 ° C) с вращением. Исправьте бусин с помощью магнитного концентратора частиц и отказаться от супернатант. Вымойте бисером трижды с 150 мкл 1 х B & W Buffer. Ресуспендируйте бисером с 50 мкл EB буфера. 6. Усиление Чиа-ПЭТ ДНК Настройка ПЦР с 2 мкл суспензии бисером, 21 мкл нуклеазы свободной воды, 1 мкл 10 мкМ Illumina 1-454 грунтовки, 1 мкл 10 мкМ Illumina 2-454 грунтовки и 25 мкл Phusion High Fidelity Master Mix. Чтобы определить число циклов, необходимых для создания достаточно продуктов ПЦР для секвенирования, созданы три теста ПЦР с 16, 18 и 20 циклов. Не более 20 циклов, как мы выяснили, что таким образом приводит к очень низкой библиотеки сложности. Первым шагом 30 секунд 98 ° C (Денатурации) От 18 до 25 циклов 10 секунд 98 ° C (Денатурации) 30 секунд 65 ° C (Отжиг) 30 секунд 72 ° C (Продолжение) Заключительный шаг 5 минут 72 ° C (Последнее продление) Определение минимально возможного числа циклов, выполнив ПЦР на 4-20% градиентного гель КЭ и окрашивания SYBR Green I, обеспечение присутствия группы из 223 пар оснований, который длину Чиа-ПЭТ ДНК. Усиление остальных Чиа-ПЭТ ДНК-связанных стрептавидином бусины в крупномасштабных ПЦР с минимальным количеством циклов ПЦР насколько это возможно, до сих пор получить достаточную доходность для секвенирования. Повторнопретензии бусы из всех реакций ПЦР с использованием магнитных частиц концентратора и бассейн супернатант два свежих труб LoBind ДНК. Ускорить каждую пробирку супернатанта путем добавления 60 мкл 3 М ацетата натрия, 2 мкл GlycoBlue и 600 мкл изопропанола, объединенных реакции. Инкубировать при температуре -80 ° С в течение 30 минут. Центрифуга на 16 110 мкг (13 200 оборотов в минуту) в течение 30 минут при 4 ° C. После центрифугирования изопропанола осажденного ДНК, ДНК стирки гранулы с 75% ледяной этанола в два раза и ДНК ресуспендируют осадок в 100 мкл буфера TE и 5 мкл 6 х загрузкой красителя. Распространение продуктов ПЦР равномерно в лунки на 6% TBE геля. Запустите геля в 1 буфер х КЭ на 200 В в течение 35 минут и пятна с SYBR Green I. Визуализируйте гель с темно трансиллюминатор Reader. Тщательно акцизного 223 б.п. группа из геля и выполнять "гель давка" экстракции ДНК протокол следующим образом: Поместите вырезали фрагменты геля в 0,6 мл MicroCentrifuge трубы, которые пронзили внизу с 21-G иглы. Положите в каждую пробирку 1,5 мл винт трубы крышку центрифуги и на 16 110 мкг (13 200 оборотов в минуту) в течение 5 минут при 4 ° C. Добавить 200 мкл ТЕ буфера рН 8,0, в каждую пробирку и обеспечить гель части полностью погружены в буфере. Замораживание при -80 ° С в течение часа и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи. Передача гель куски вместе с буфером в каждую пробирку с фильтром чашку фильтра центрифужные пробирки и центрифуги в 16 110 мкг (13 200 оборотов в минуту) в течение 10 минут при 4 ° C. Промыть каждую 1,5 мл трубки с 200 мкл ТЕ буфера рН 8,0 и передачи промывки буфером для каждого фильтра после завершения первого спина. Бассейн фильтра и через осадок изопропанола. Ресуспендируйте ДНК гранул с 15 мкл буфера ТЕ. 7. Проверка качестваг Усиление Чиа-ПЭТ ДНК Приступить к проверке качества использованием ДНК Agilent 1000 пробирной или Agilent высокой Анализ ДНК чувствительность на Agilent биоанализаторе 2100 года. Electropherogram на анализе ДНК Agilent должны отображаться только один пик, а также плоские базовые прежде чем приступить к Illumina Genome Analyzer IIx последовательности. До Illumina Genome Analyzer IIx последовательности, Чиа-ПЭТ ДНК в идеале должны иметь как минимум концентрации 10 нМ. Выполните 4-балльной количественной ПЦР в соответствии с Illumina КПЦР Руководство протокола количественного определения количества образцов для загрузки на потоке клеток. Кроме того, выполняют одну точку количественной ПЦР следующим образом: Развести управления шаблона 100 мкм, 10 вечера и 1 вечера. Как указано в протоколе Illumina Количественное КПЦР, шаблон элемента управления определяется как любой библиотеке подготовлены для секвенирования на платформе Illumina и она должна быть максимально схожей с точки зренияШаблон размера, GC содержание и библиотеки типов. Развести Чиа-ПЭТ ДНК до 10 вечера. Настройка ПЦР triplicates каждого разбавления 0,1 мкл праймера КПЦР 1.1, 0,1 мкл праймера КПЦР 2.1, 5 мкл ДНК LightCycler480 SYBR Green I Master Mix, 3,8 мкл нуклеазы без воды и 1 мкл шаблон Roche Applied Science LightCycler 480 в режиме реального времени ПЦР-системы. Включает два отрицательных элементов управления с помощью 1 мкл нуклеазы без воды в качестве шаблона. Начальная Денатурация 95 ° C 5 минут 4.8 ° C / с Усиление 95 ° C 10 секунд 4.8 ° C / с 60 ° C 1 минута 2,5 ° С / с 72 ° C 30 секунд 4.8 ° C/ С Кривая плавления 95 ° C 5 секунд 4.8 ° C / с 65 ° C 1 минута 2,5 ° С / с 95 ° C 5 приобретений в ° C Охлаждение 40 ° C 10 секунд 2,0 ° С / с Убедитесь, что отрицательного контроля не показывают усиление и стандартное отклонение для значений Ct менее 0,1 до расчета концентрации в библиотеку шаблонов на основе стандартной кривой, полученной от разведения шаблона элемента управления. Создание кластеров на поверхности клеток Illumina поток, загрузив 1:05 вечера Intо Illumina CBOT кластера поколение системы в соответствии с инструкциям на экране. Приступить к последовательности Чиа-ПЭТ ДНК на Illumina Genome Analyzer IIx использованием Illumina 3-454 грунтовка последовательности и Illumina 4-454 последовательности праймера в одну полосу, чтобы увидеть качество библиотеки. Храните оставшиеся Чиа-ПЭТ ДНК при температуре -20 ° C. Если библиотека имеет хорошие данные, подготовка образцов для дополнительных трасс от 4 до 8 полос по мере необходимости по результатам образец полосы получить от 18 до 20 миллионов уникальных чтения. Количество Чиа-ПЭТ ДНК загружен на потоке клеток в значительной степени зависит от версии программного обеспечения виртуализации, анализ данных, последовательное управление Студия Illumina в. Для версии 2.9, загрузка концентрация составляет от одной трети до половины максимальной мощности каждой плитки, что составляет около 21 млн. пасс фильтром читает около 9500000 читает животных. Снижение нагрузки необходимо для обеспечения правильного базового вызова еили штрих-код последовательности линкеров. Эта ошибка возникает, когда большое число подобных последовательность нуклеотидов, как в случае, если компоновщик последовательности, чтобы получить штрихового кодирования информации. Если штрих-кодирование информации не требуется, и линкеры не читали, то полной концентрации нагрузки могут быть использованы. QSeq файлы преобразуются сообщение вызывающей базы могут быть в дальнейшем проанализированы с использованием Чиа-ПЭТ инструмент в соответствии с Чиа-ПЭТ инструмент руководство по установке (версия 4.1) 8. С представителем Чиа-ПЭТ Результаты Мы успешно построен Чиа-ПЭТ библиотек с использованием РНК-полимеразы II антител (8WG16) в MCF-7 клеток (CHM160 и CHM163) 9 с использованием 672 нг стружки, как описано выше. Первичной диагностики гель запуска этого ПЦР-библиотеки усиливается, как указано в шаге 6.2 Chia-ПЭТ протокола, отображается яркие и четкие полосыОжидается размере 223 пар оснований, для всех велосипедных ПЦР используется (см. Рисунок 4). 16 циклов ПЦР был использован для усиления Чиа-ПЭТ библиотеку и общий выход 17,1 нг было получено. Один, интенсивный пик electropherogram наблюдается в ожидаемом размере 223 пар оснований с помощью анализа ДНК Agilent 1000, как упомянуто в шаге 7.1 Chia-ПЭТ-протокола (см. Рисунок 5). Рисунок 1. ChIP обзор. MCF-7 клеток двойного сшитые с EthylGlycol бис (SuccinimidylSuccinate (ЭТУ) и формальдегид последовательно, в результате ковалентной связи между пространственно смежных хроматина. Сшитого хроматина была получена из фиксированной MCF-7 клеток лизиса клеток и ядерной лизиса. хроматина затем подвергается фрагментации диапазон размеров 200-600 пар оснований. После предварительной очистки ультразвуком хроматина с ПротейП О магнитных шариков для удаления неспецифических ДНК, предварительно очищена хроматина immunoprecipitated ночь с антителами бисером захватить хроматина интерес. Рисунок 2. Гель для анализа ультразвуком фрагменты хроматина. 100 б.п. ДНК лестнице показан на первой и последней полос на размер ссылки. Ультразвуком хроматина отображается сильной интенсивности от 200 до 600 б.п., который идеально подходит для захвата дальнодействия хроматина. Рисунок 3. Чиа-PET обзор. Фрагментированные фрагменты хроматина являются конечными притупляются и лигировали биотинилированного половины линкеры содержащих фланкирующие сайты MmeI ограничений. Неповрежденная комплексов хроматина затем элюировали бисером и подвергается непосредственной близости перевязки в крайне разбавленных условиях, например, что взаимодействие фрагментов ДНК предпочтенияerentially лигируют друг с другом. После того, как обратная сшивка для удаления ДНК-связанного белка, MmeI пищеварение осуществляется выпустить тег-линкер-теги (ПЭТ) конструкции, которые затем очищают селективного связывания с стрептавидином шарики. ПЭТ конструкций лигируют с адаптерами для высокой пропускной последовательности. Рисунок 4. Гель для анализа Чиа-ПЭП после ПЦР-амплификации. 25 б.п. ДНК лестнице показан в полосе 1 и 5 по размеру ссылки. Дорожки от 2 до 4 ПЦР продуктов, произведенных после 16, 18 и 20 циклов ПЦР от 2 мкл шарик-иммобилизованных шаблон, соответственно. Это успешный библиотеке, о чем свидетельствуют яркие, четко определенных зон на ожидаемый размер составляет 223 базисных пунктов. Неспецифические мазка возникает тогда, когда количество циклов ПЦР увеличивается при низкой полосе каждой реакции ПЦР состоит из грунтовки димеров. <img src= "/ Files/ftp_upload/3770/3770fig5.jpg" alt = "Рисунок 5" /> Рисунок 5. Agilent 2100 биоанализаторе анализ очищенной Illumina-454 адаптера лигируют Чиа-ПЭП. Экран захвата Agilent 2100 электрофореграммы биоанализаторе профилирования успешно библиотеки, с одной интенсивный пик на ожидаемый размер составляет 223 базисных пунктов. Обратите внимание, что Agilent биоанализаторе анализ обычно сообщает немного выше, чем ожидалось, размер, в данном случае, желаемый пик отображается на 237 б.п. вместо 223 б.п.. Это в пределах 10% ошибка диапазон анализа Agilent.