Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

A. cromatina imunoprecipitação (CHIP) (ver Figura 1) 1. Reticulação dupla de cromatina e proteínas ligadas a colheita de células (A 02:10 do vídeo) Cromatina imunoprecipitação (ChIP) é o primeiro passo crítico envolvidos na construção de uma biblioteca de Chia-PET. Este passo é importante para reduzir o nível de complexidade ruído de fundo, e adicionar especificidade. A preparação do chip precisam ser otimizados para o tipo celular e fator de interesse. Este protocolo é baseado sobre a RNA polimerase II biblioteca Chia-PET preparado a partir de células MCF-7 9 construídos no nosso laboratório. Para garantir que a biblioteca resultante é de complexidade suficiente, é recomendável usar 1 x 10 8 células para preparar o material ChIP. Dependendo da linha de células alvo e, o rendimento obtido pode estar compreendida entre 100 ng a 300 ng. Sugerimos que um mínimo de 100 ng ChIP devem ser utilizados para construct uma biblioteca de Chia-PET com menos de 20 ciclos de PCR para minimizar a redundância durante sequenciação. Quantidades maiores de material de chip permitir uma redução adicional de redundância, melhorando a qualidade das bibliotecas. Lavar 1 x 10 8 células MCF-7 (equivalente a 500 cm 2 cinco placas quadradas de 2 x 10 7 células) por duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) pré-aquecida a 37 ° C. Crosslink células MCF-7 com 1,5 mM recentemente preparada EthylGlycol bis (SuccinimidylSuccinate) (EGS)) durante 45 minutos à temperatura ambiente (22 ° C) com rotação em uma capa química de fumos. Adicionar formaldeído a 37% para uma concentração final de 1% durante 20 minutos à temperatura ambiente (22 ° C) com rotação em uma capa química de fumos. Extinguir os reticuladores por adição de 2 M de glicina para uma concentração final de 200 mM. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente(22 ° C) com rotação. Descartar reticuladores temperados para um balão de resíduos e lavar as células duas vezes com PBS frio. Descarte PBS e as células de colheita por raspagem. Manter as células colhidas em gelo. Lavar a placa com PBS 5ml (com inibidores de protease ("+ PI") adicionado de acordo com as instruções do fabricante) para maximizar a recolha de células. Sedimentar as células a 1.800 xg (3000 rpm) durante 10 minutos a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e proceder à lise celular. Alternativamente, armazenar o pellet a -80 ° C. 2. Lise Celular (A 04:15 do vídeo) Ressuspender o granulado em 15 ml Tampão de Lise 0,1% de SDS (HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton a 1% X-100, desoxicolato de sódio a 0,1%, 0,1% SDS + PI) cuidadosamente por pipetagem. Girar durante 15 minutos a 4 ° C. Pellet lisadas células de 800 xg (2000 rpm) durante 10 minutos a 4 ° C. Elimine o sobrenadante e repetir a lise celular uma vez por passo como 2,1 e 2,2. O isolado nuclear pelete está pronto para a lise nuclear. Alternativamente, armazenar pellet a -80 ° C. 3. Lise Nuclear (A 05:00 do vídeo) Lise nuclear é realizada para libertar cromatina reticulado antes fragmentação da cromatina. Na ausência de membrana nuclear, a cromatina reticulado pode ser sonicada utilizando condições mais suaves. Às vezes, a força de sonicação pode não ser suficiente para romper a membrana nuclear, caso em que, menos de cromatina será obtida porque os núcleos intactos serão descartados após centrifugação. No entanto, diferentes tipos de células podem exigir condições diferentes. Ressuspender o sedimento isolado núcleos em 15 ml de 1% SDS tampão de lise (50 mM HEPES pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Triton X-100 de sódio, 0,1% Deoxycholate, SDS a 1% + PI). Transferir suspensão núcleos para um tubo de centrífuga de alta velocidade (Oak Ridge do tubo de centrifugação (polipropileno)) e girar durante 15 minutos a 4 ° C. Pellet lisadas núcleos pellet em 47.810 xg (20.000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C. Decantar o sobrenadante e pellet ruptura com uma ponteira p1000. Lavar pelete com 30 ml de 0,1% SDS tampão de lise (+ PI). Girar durante 15 minutos a 4 ° C. Pellet cromatina em 47.810 xg (20.000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C. Elimine o sobrenadante e repetir lavar uma vez por passo como 3,4-3,6 antes de proceder à fragmentação da cromatina. Alternativamente, armazenar cromatina pellet a -80 ° C. 4. A fragmentação da cromatina (A 07:03 do vídeo) Transferência de cromatina pelete a um poliestireno tubo redondo de 14 ml de teste de fundo. Adicionar 1 ml 0,1% de SDS tampão de lise (+ PI) a cromatina epllet. Garantir que não haja bolhas na mistura, como isso vai afetar a eficiência de sonicação. Cisalhamento cromatina-DNA para um tamanho de 200 a 600 pares de bases com um Branson Digital Sonifer celular Disrupter (amplitude de 35%, 9 minutos (30 segundos em, 30 segundos desligado)) e manter as amostras a frio a todo o tempo para evitar o sobreaquecimento, realizando o sonicação num quarto frio (ver Figura 2). Reverse-reticular uma aliquota de cromatina e verificar a eficiência fragmentação com os seguintes passos. (Os passos seguintes não são mostrados no vídeo). UL alíquota de 10 de cromatina após sonicação. Centrifugar sonicada cromatina em 16.110 xg (13.200 rpm) durante 5 minutos a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e adicionar 2 ul de proteinase K solução. Incubar durante 30 minutos a 50 ° C. Resolver inverter-reticulado cromatina em um gel de agarose 1,5%. REPEAt sonicação se os tamanhos de DNA são maiores do que o esperado. Centrifugar lisado restante em 16.110 xg (13.200 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C e transferência sonicada cromatina (sobrenadante) em um tubo novo antes preclearing com esferas magnéticas. Alternativamente, armazenar sonicada cromatina a -80 ° C até cromatina suficiente é recolhido para iniciar um chip. 5. Preclearing lavagem, e Revestimento de Anticorpo para o Beads (A 08:17 do vídeo) Preclearing da cromatina Use 300 ml de contas G magnéticos de proteína para um IP. Lavar três vezes com pérolas de 5 contas ml Tampão de Lavagem (PBS, 0,1% de Triton X-100). Este e futuro lavagens envolvendo esferas magnéticas proteína G consiste nas etapas seguintes. Certifique-se de esferas magnéticas não sequem. Recupere contas usando um concentrador de partículas magnéticas. Discard sobrenadante. Ressuspender grânulos com tampão. Girar durante 5 minutos a 4 ° C. Centrifugar a 129 xg (800 rpm) durante 1 minuto a 4 ° C. Recupere contas usando um concentrador de partículas magnéticas. Elimine o sobrenadante. Combinar cromatina sonicado com grânulos lavados, para remover ligação de fundo da cromatina de grânulos. Mantenha 10 ul de cromatina sonicado como "entrada" para verificação posterior enriquecimento por PCR quantitativo (qPCR). Armazenar a 4 ° C. Rodar a noite a 4 ° C. Centrifugar sonicada cromatina em 129 xg (800 rpm) durante 1 minuto a 4 ° C. Coloque o tubo no concentrador de partículas magnéticas. Anticorpo de revestimento para esferas magnéticas UL alíquota 300 de pérolas magnéticas de proteína G para um tubo fresco. Lavar três vezes com tampão de grânulos 5ml grânulos de lavagem (PBS, 0,1% de Triton X-100). Adicionar um volume equivalente (como passo 5.1.3) de grânulos de tampão de lavagem. Adicionar 35 ug de RNA polimerase II (8WG16) anticorpo monoclonal. Rodar a noite a 4 ° C. Lavar revestidas com anticorpo grânulos duas vezes com 5 mL de tampão de lavagem Beads. Reclaim revestidas com anticorpo grânulos utilizando um concentrador de partículas magnéticas. 6. Cromatina imunoprecipitação (A 10:03 do vídeo) Para reduzir o nível de complexidade e ruído de fundo, anticorpos contra factores proteicos específicos são utilizados para enriquecer fragmentos de cromatina específicos de interesse antes da ligadura proximidade 6. Aqui, utilizou-se um rato RNA polimerase II monoclonalanticorpo (8WG16) que reconheceram a forma de iniciação da proteína. Por fragmentos de ADN de enriquecimento que estão associados com a RNA polimerase II, a especificidade da biblioteca pode ser aumentado, permitindo a identificação de interacções de longo alcance de cromatina entre promotores activos e os seus correspondentes regiões reguladoras 9. Descartar o tampão de lavagem a partir de anticorpo-esferas cobertas com a ajuda de um concentrador de partículas magnéticas. Transferência sonicada cromatina (sobrenadante do passo 5.1.6) com a ajuda do concentrador de partículas magnéticas revestidas com anticorpo para grânulos (a partir do passo 5.2.7). Rodar a noite a 4 ° C. 7. Lavagem e eluição de imunoprecipitadas DNA-proteína Complexos (A 11:13 do vídeo) Lavar cromatina-imunoprecipitadas grânulos três vezes com 5 ml Tampão de Lise 0,1% de SDS. Lavar uma vez com pérolas de 5 ml de Tampão de Lavagem alta Sal (50 mM HEPES pH 7,5, 350 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% de Triton X-100, desoxicolato de sódio a 0,1%, 0,1% de SDS). Lavar uma vez com pérolas de 5 ml de Tampão de Lavagem cloreto de lítio (10 mM Tris pH 8,0, 250 mM de LiCl, 1 mM de EDTA, 0,5% de Nonidet P-40, desoxicolato de sódio a 0,5%). Descarte o tampão de lavagem e ressuspender contas lavadas com 1 ml de tampão TE. Girar durante 5 minutos a 4 ° C. A amostra está pronta para a quantificação e verificação de enriquecimento ChIP. Uma vez que o material ChIP suficiente foi recolhido, a amostra está pronta para ser construída em uma biblioteca de Chia-PET. Este passo é crítico, e deve ser feito para assegurar a construção da biblioteca de sucesso Chia-PET. ChIP enriquecidas pérolas podem ser armazenado por até 2 semanas a 4 ° C, enquanto a sofrer de quantificação, o controlo de enriquecimento, Chip e acumulação de material suficiente. Eluir e reverse-reticulação "input" de DNA e Chip enriquecidos contas com as seguintes etapas. (Os passos seguintes não são mostradas no vídeo.) Eluir 20% de Chip enriquecidas pérolas com 200 ul tampão ChIP eluição (50 mM Tris pH 8,0, EDTA 10 mM, SDS 1%). Girar durante 30 minutos a 37 ° C. Centrifugar grânulos eluída a 6100 xg (800 rpm) durante 1 minuto a 4 ° C. Transferir eluídas complexos chip (sobrenadante) para um novo tubo, com a ajuda do concentrador de partículas magnéticas. Reverse-reticulação "de entrada" e eluída complexos chip com 2 ul de proteinase K (concentração final de 0,2 g / ml) durante 2 horas a 50 ° C. Transferência inversa-reticulado "input" de DNA e DNA ChIP eluído em um 2 ml Densidade MaXtract alta (respectivamente). Adicionar 200 uL 25:24:1 pH Álcool fenol-clorofórmio-isoamilo 7,9 para os tubos em um capuz química de fumos e inverter para misturar bem. Girar os tubos durante 5 minutos a 16.110 xg (13.200 rpm) à temperatura ambiente. De transferência de fase aquosa superior para um novo tubo e precipitar inverter wit DNA reticuladoh 20 uL 3 M pH Acetato de Sódio 5,5, 200 uL de isopropanol e 1 uL de 15 mg / ml Glycoblue. Incubar a -80 ° C durante 30 minutos e DNA sedimento durante 30 minutos a 16.110 xg (13.200 rpm) a 4 ° C. Após a centrifugação de ADN precipitado isopropanol, lavar DNA pelete com 75% de etanol arrefecido com gelo duas vezes e ressuspender o pellet em DNA 20 uL de tampão TE. Quantificar "input" DNA (do passo 5.1.3) e DNA chip por picogreen ensaio 10. Execute uma verificação de enriquecimento através de PCR qualitativa (qPCR). B. Análise de Interação Cromatina usando Emparelhado Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) A segunda metade do vídeo será destacar os passos chave na construção de uma biblioteca de Chia-PET. 1. Fim embotamento-de fragmentos de ADN ChIP Este capítulo do vídeo destaca dois mpontos Ain, um procedimento passo-a-passo de lavagem esferas magnéticas para remover as enzimas e tampão sal da reacção anterior (Passo 1,1, 12:22-12:54 do vídeo) e do procedimento de criação de reacções enzimáticas que envolvem as esferas magnéticas na mistura de reacção (Passo 1,2, 12:54-13:25 de vídeo). Lavar ChIP enriquecidas grânulos uma vez com tampão gelado de TE. Isto e futuro lavagens envolvendo esferas magnéticas constituída pelas seguintes etapas. Centrifugar a 6.100 xg (800 rpm) durante 1 minuto a 4 ° C. Recupere contas usando um concentrador de partículas magnéticas. Elimine o sobrenadante. Adicionar tampão de contas. Misture contas com o tampão por um movimento súbito ação. Centrifugar a 6.100 xg (800 rpm) durante 1 minuto a 4 ° C. Recupere contas usando um concentrador de partículas magnéticas. Elimine o sobrenadante. Para preencher overha sonicadongs, preparar um mestre de mistura com 70 x tampão de uL 10 para DNA polimerase de T4, 7 uL de 10 mM de dNTPs e 615,8 água livre de nuclease uL. Misture bem e volte a suspender contas lavados com o mestre-mix. Adicionar 7,2 uL 9,7 U / uL de polimerase de ADN T4 para um volume final de 700 uL. Misturar e incubar durante 40 minutos a 37 ° C com rotação (usando Palico Biotech Intelli-Mixer RM-2L, F8, 30 rpm, U = 50, u = 60). Realize todas as reações enzimáticas subsequentes com as seguintes etapas. Diluir buffers de reacção com nuclease livre de água. Adicionar todos os outros reagentes (excepto enzimas) a solução tampão diluída. Misturar bem. Ressuspender contas / pelota com uma mistura de reação. Adicionar enzima para grânulos em suspensão / pellet (Mantenha enzimas na caixa térmica bancada em todas as vezes para garantir a atividade enzimática máxima). Selar o tubo com parafilme. Assegurar que os grânulos são bem misturados durante todo o incubatio inteiron. Descartar mistura de reacção e lavar os sais do tampão residuais e enzimas três vezes com tampão gelado de lavagem (10 mM Tris-Cl pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM). 2. Ligadura de biotinilados Meio-Linkers de DNA ChIP Este capítulo do vídeo destaca as características dos oligonucleótidos meia-ligante utilizados na construção de Chia-PET e à utilização da composição de código de barras de nucleótidos para distinguir entre produtos de ligação não específicos e específica (13:28-14:24) do vídeo). O capítulo também mostra o procedimento passo a passo da criação de uma reacção de ligação semi-linker (Passo 2.2, 14:24-15:54 do vídeo). Dois tipos de biotiniladas meias-linkers são introduzidos neste protocolo e foram concebidos com o código de barras interno de quatro nucleotídeos (TAAG ou ATGT) e um sítio de reconhecimento para o tipo de restrição IIS enzima CEMm (TCCAAC). Depois de enriquecer ChIPmento, sonicada fragmentos de cromatina são divididas igualmente em duas alíquotas e são primeiro ligados com um excesso de B, quer meia-ligante A ou meia-ligante 5,9. Divide ChIP enriquecidas grânulos em duas alíquotas de DNA ligation meia-ligante por biotinilados meias-linkers A ou meias-linkers B, respectivamente. Estas duas meias-linkers têm as mesmas sequências de nucleótidos, excepto quatro nucleótidos no meio, que servem (Metade ligante-A com TAAG; B meia-ligante com ATGT) como códigos de barras de nucleótidos. Quando combinado durante a ligadura de proximidade, aleatório e não-específicos ligaduras entre dois complexos chip diferente pode ser identificada a partir da população de sequências com ligantes heterodímero AB, em comparação com ligaduras específicos que podem ser identificados a partir da população de sequências com homodímero AA ou BB linkers . Ligadura ChIP enriquecidas pérolas com 140 x 5 uL de tampão DNA ligase de T4 com PEG, 3,5 ul de 200 ng / uL biotinilados meias-linkers A ou B, 553,5 ul de nucleaseágua livre e 3 ul de 30 U / uL de T4 DNA ligase (Keep DNA ligase de T4 em uma caixa de refrigerador de bancada em todos os momentos como ligases são instáveis, mesmo em gelo). Selar o tubo com parafilme e incubar durante a noite a 16 ° C com rotação. 3. Eluição e Ligadura de proximidade de fragmentos de DNA da microplaqueta Este capítulo do vídeo explica o papel de tampão de EB, SDS e Triton X-100 durante a eluição dos complexos de cromatina de grânulos e também mostra o procedimento passo-a-passo da criação de uma reacção circularização (Passo 3,9, 15:54 para 17:10 do vídeo). Após ligadura dos linkers meia-para os fragmentos de cromatina, ambas as fracções são combinadas e eluído os grânulos. Os fragmentos de DNA que interagem irá então ser ligado por uma sequência completa ligante durante a ligadura de proximidade. Usando a composição de código de barras de nucleótidos, as sequências podem ser classificados em três categorias, a saber, sequências wiª heterodímero linkers AB (código de barras ATGT / TAAG) e sequências com homodímero AA ou BB linkers (código de barras TAAG / TAAG ou ATGT / ATGT) para distinguir produtos de ligação não específicos e específicos, respectivamente 9. Assim, a utilização de duas meias-linkers com diferentes códigos de barras de nucleótidos permite a especificação de experiências diferentes ou repetições, bem como a monitorização da não-específica taxa de ligadura quimérico entre complexos chip diferente 5. Lavar meia-ligante-ligadura grânulos três vezes com tampão gelado de lavagem (10 mM Tris-Cl pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM). Combinar os dois tubos de meia-ligante-ligadura grânulos da seguinte maneira. Recuperar um dos tubos de meia-ligante-infartados contas usando um concentrador de partículas magnéticas ("Tube A"). Mantenha o outro tubo de meia-ligante-infartados contas em gelo ("Tube B"). Descarte Tampão de Lavagem (a partir do passo 3.2.1) fTubo rom A e transferir meia-ligante-ligadura grânulos (a partir do passo 3.2.2) a partir de B tubo em tubo A. enquanto tubo A está ainda no colector de partículas magnéticas Adicionar 700 ul tampão de lavagem gelada para B Tubo de recolher quaisquer resíduos semi-linker-infartados contas e garantir os dois tubos de meia-ligante-infartados contas são combinados de forma adequada. Transfira o tampão de lavagem em A. Tubo Descarte o vazio do tubo B. Fosforilam meia-ligante-ligadura pérolas com 70 uL de 10 x T4 DNA ligase tampão (NEB), 616 água livre de nuclease uL e 14 uL de 10 U / uL de Quinase T4 DNA polinucleótido. Incubar durante 50 minutos a 37 ° C com rotação. Recupere fosforilados meia-ligante-infartados contas usando um concentrador de partículas magnéticas e descartar mistura de reacção. Eluir meia-ligante-ligadura complexo cromatina-DNA com 200 uL de tampão de eluição preparado de fresco (tampão TE, 1% de SDS). Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente (22 °C) com rotação. Transferir eluato para um tubo fresco e enxaguar pérolas com 900 EB Tampão ul. Transferir o sobrenadante para o mesmo tubo de combinar as eluições. Transferir eluato recolhido para os copos de filtro de dois filtros de centrifugação de tubos e centrifugar a 16.110 xg (13.200 rpm) durante 1 minuto à temperatura ambiente (22 ° C). Sequestrar SDS por adição de 90 ul de Triton 20% X-100 e inverter para misturar bem. Incubar durante 1 hora a 37 ° C. Circularização é realizada sob condições extremamente diluídas, a fim de favorecer eventos de ligação dentro individuais complexos reticulados de cromatina, minimizando os eventos de ligação entre os complexos de cromatina diferentes que dariam origem a moléculas de ADN quiméricas indesejáveis. Trabalhando em gelo, transferir eluato temperada para um tubo Falcon 50 ml e adicionar 7776 de água livre de nuclease ul, 1000 uL 10 x T4 DNA tampão ligase (NEB) e 33,33 ul de 30 U / ul de ligase do DNA de T4. Incubar durante a noite a 16° C. 4. Reverso-reticulação e DNA Purificação Este capítulo do vídeo mostra o procedimento passo-a-passo de fenol: clorofórmio (Passo 4,3, 17:11-17:59) ea fechar-se do DNA sedimentado após centrifugação na Etapa 4.4. Reverse-reticulação e proteína degradar por adição de 100 uL de 20 mg / ml de Proteinase K solução. Incubar durante 2 horas a 50 ° C. Transferir DNA cromatina em um 50 ml de Densidade MaXtract alta e adicionar 9ml de água livre de nuclease para se obter um volume final de 19 ml. Adicionar 19 ml de álcool 25:24:1 pH fenol-clorofórmio-isoamilo 7,9 para o tubo num capuz química de fumos e inverter para misturar bem. Girar os tubos durante 5 minutos a 1800 xg (3000 rpm) à temperatura ambiente. De transferência de fase aquosa superior a de 50 ml de Oak Ridge da Tubos de centrífuga (Teflon FEP) e DNA precipitado com cromatina 1,9 3 M pH ml Acetato de Sódio 5,5, 19 ml isopropanol e 5 Glycoblue uL. Glycoblue é adicionado para melhorar a visibilidade do sedimento. Incubar a -80 ° C durante pelo menos uma hora. Permitir que a solução congelada para descongelar antes da centrifugação a 38.720 xg (18.000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C. Após a centrifugação de ADN precipitado isopropanol, lavar DNA pelete com 75% de etanol arrefecido com gelo duas vezes e ressuspender o pellet em 34 de DNA EB Tampão ul. Transfira a mistura de DNA para um tubo de 1,7 ml LoBind DNA. Ressuspender o pellet de DNA em 34 ul de buffer EB. (Tratamento RNase é opcional, lavagem posterior e etapas de purificação do protocolo Chia-PET servem para remover contaminantes RNA e inspeções manuais das seqüências de Chia-PET de nossa casa, nas bibliotecas têm demonstrado nenhum vestígio de contaminação RNA). Realizar a digestão com RNase por adição de 10 ul de ARNase UM 10 Tampão de Reacção x, 55 de água livre de nuclease uL e 1 uL de 10 U / uL de RNase ONE ribonuclease. Incubar a 37° C durante uma hora. Transferir DNA cromatina em um 2 ml Densidade MaXtract alta. Adicionar 100 ul 25:24:1 pH Álcool fenol-clorofórmio-isoamilo 7,9 para o tubo num capuz química de fumos e inverter para misturar bem. Girar o tubo durante 5 minutos a 16.110 xg (13.200 rpm) à temperatura ambiente (22 ° C). De transferência de fase aquosa superior para um novo tubo e precipitado reversa reticulado de ADN com 10 3 M pH uL Acetato de Sódio 5,5 e 100 ul de isopropanol. Incubar a -80 ° C durante 30 minutos e DNA sedimento durante 30 minutos a 16.110 xg (13.200 rpm) a 4 ° C. Após a centrifugação de ADN precipitado isopropanol, lavar o sedimento de DNA com 75% de etanol arrefecido com gelo duas vezes e ressuspender o pellet em 34 de DNA EB Tampão ul. 5. Imobilização de Chia-PET DNA para Beads estreptavidina A introdução deste capítulo fala sobre a presençado sítio de reconhecimento CEMm e do T biotinilado presente nos oligonucleótidos meia-ligante para facilitar a extracção de tag-ligante-tag construções ("TAP", 18:02-19:10 do vídeo). Além disso, este capítulo do vídeo também dá uma visão rápida total de Passo 5.2, o procedimento passo a passo da criação de uma reação de PCR (Passo 6.1, 19:10-20:00 do vídeo) e excisão uma bem-sucedida Chia-PET DNA (Passo 6,9, 20:00 às 20:30 h). Meias-linkers A e B contêm acompanhamento sítios de reconhecimento CEMm, permitindo este tipo de enzima de restrição IIS para cortar pares 18/20 a jusante da base de seus locais de destino de ligação para gerar curtos "tags" do fragmento de cromatina, produzindo pares de tag-tag-linker construções ("PET"). Para permitir a purificação de construções de PET por estreptavidina-esferas magnéticas revestidas, tanto meia-ligante A e B são modificados com biotina, permitindo que a captura e purificação dos construtos Chia-PET. Lançamento cDNA Chia-PET aptured pela adição de 5 uL de 10 x NEBuffer 4, 5 uL de 500 uM preparado de fresco (10 x) de S-adenosilmetionina (SAM) e 1 uL 2 U / uL CEMm ao DNA ressuspenso. Têmpera CEMm excesso por adição de 5 uL não biotinilado meias-linkers a mistura de reacção durante CEMm pode ser auto-inibitória em excesso. Incubar durante 2 horas a 37 ° C. Para capturar Autorização Chia-PET de ADN 50 l, a transmissão de ressuspensos grânulos M-280 de estreptavidina a um tubo de LoBind DNA. Lavar duas vezes com pérolas de 2 x de ligação e de Tampão de Lavagem (2 x B e W: 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 2 M). Ressuspender grânulos em 50 uL 2 x tampão B e W e transferir 50 uL de mistura de digestão (a partir do passo 5.1) ao mesmo tubo. Misturar bem e incubar durante 45 minutos à temperatura ambiente com rotação. Recupere contas usando um concentrador de partículas magnéticas e elimine o sobrenadante. Lavar duas vezes com pérolas de 150 uL de 1 x tampão de ligação e de lavagem (1 x B e W: 5 mM de Tris-HCl pH 7,5, EDTA 0,5 mM, NaCl 1 M). <li> Ligadura 454 GS20 Adaptadores para Chia-PET DNA com 5 x 10 ul tampão ligase T4 DNA (Note-se que o tampão ligase utilizado neste passo é diferente a partir do passo 3.9, o tampão ligase utilizado neste passo é da mesma companhia como a que abastece o DNA-ligase de T4), 4 uL de 200 ng / uL 454 GS20 adaptador A, 4 uL de 200 ng / uL 454 B adaptador GS20, 36 de água livre de nuclease uL e 1 uL de 30 U / ul de ligase do DNA de T4. Incubar durante a noite a 16 ° C com rotação. Chia-PET ADN também pode ser ligado com Illumina-NN adaptadores, caso em que é recomendável amplificação da biblioteca utilizando o iniciador de PCR PE1.0 e iniciador de PCR PE 2,0 comprado de Illumina. Recupere contas usando um concentrador de partículas magnéticas e elimine o sobrenadante. Lave contas três vezes com 150 ul 1 x B & W Buffer. Nick traduzir DNA Chia-PET com 5 uL de 10 x NEBuffer 2, 2,5 ul de 10 mM, dNTPs 38,5 de água livre de nuclease uL e 4 uL 10 U / uL de Escherichia coli DNA polimerase I. Incubar durante a noite àtemperatura ambiente (22 ° C) com rotação. Recupere contas usando um concentrador de partículas magnéticas e elimine o sobrenadante. Lave contas três vezes com 150 ul 1 x B & W Buffer. Ressuspender grânulos com 50 EB Tampão ul. 6. A amplificação de Chia-PET ADN Configure as reações de PCR com 2 pérolas suspensão ul, 21 ul água livre de nuclease, 1 ul 10 mM de primers 1-454 Illumina, 1 ul 10 mM de primers 2-454 Illumina e 25 ul Phusion High Fidelity Mix Master. Para determinar o número de ciclos necessários para gerar produtos de PCR suficiente para sequenciação, configurar três reacções de teste de PCR com ciclos de 16, 18 e 20. Não exceder 20 ciclos como nós descobrimos que fazendo resultados assim em complexidade biblioteca muito baixa. Passo inicial 30 segundos 98 ° C (Desnaturação) 18 a 25 ciclos 10 segundos 98 ° C (Desnaturação) 30 segundos 65 ° C (Recozimento) 30 segundos 72 ° C (Extensão) Etapa Final 5 minutos 72 ° C (Extensão final) Determinar o número do ciclo mais baixo possível, executando as reacções de PCR num gel de 4-20% gradiente de TBE e coloração com SYBR Green I, assegurar a presença de uma banda de 223 pares de bases, que é o comprimento do DNA Chia-PET. Amplificar o resto dos grânulos de PET Chia-DNA-bound estreptavidina em uma PCR em grande escala com tão poucos ciclos de PCR quanto possível e ainda a obtenção de rendimento suficiente para sequenciação. Recontas reivindicação de todas as reações de PCR usando um concentrador de partículas magnéticas e piscina sobrenadante para dois tubos LoBind frescas de DNA. Precipitar cada tubo de sobrenadante por adição de 60 uL acetato de sódio 3M, 2 GlycoBlue uL e 600 uL de isopropanol para reacções em pool. Incubar a -80 ° C durante 30 minutos. Centrifugar a 16.110 xg (13.200 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C. Após a centrifugação de ADN precipitado isopropanol, lavagem DNA pelete com 75% de etanol arrefecido com gelo duas vezes e DNA ressuspender o pellet em 100 uL de tampão TE e 5 ul de corante de carga 6 x. Distribuir produtos de PCR uniformemente nas cavidades de um gel de TBE 6%. Executar o gel em 1 x tampão TBE a 200 V durante 35 minutos e mancha com SYBR Green I. Visualize o gel com um leitor de Transilluminator escuro. Cuidadosamente especial de consumo a 223 pb a partir da banda de gel e executar "gel esmagamento" protocolo de extracção de ADN como se segue: Coloque fragmentos de gel excisadas em 0,6 ml microCtubos entrifuge que foram perfurados na parte inferior com uma agulha de 21-G. Coloque cada tubo dentro de um tubo de 1,5 ml tampa de rosca e centrifugar a 16.110 xg (13.200 rpm) durante 5 minutos a 4 ° C. Adicionar 200 uL de TE pH 8,0 a cada tubo e assegurar que os pedaços de gel são totalmente imersos no buffer. Congelar a -80 ° C durante uma hora e incubar a 37 ° C durante a noite. Transferir pedaços de gel em conjunto com o tampão em cada tubo para o copo de filtro de um filtro de tubo de centrífuga e centrifugar a 16.110 xg (13.200 rpm) durante 10 minutos a 4 ° C. Lavar cada tubo 1,5 ml com 200 ul de tampão TE pH 8,0 e tampão de transferência de lavagem para cada unidade de filtro após a conclusão do spin em primeiro lugar. Piscina filtro de passagem e precipitado com isopropanol. Ressuspender o sedimento de DNA com 15 ul de tampão TE. 7. Qualidade Verificar umAmplificação d de Chia-PET DNA Prossiga com a verificação da qualidade usando DNA Agilent 1000 Assay ou Ensaio Agilent DNA de alta sensibilidade em Agilent Bioanalyzer 2100. O electroferograma do ensaio DNA Agilent deverá apresentar apenas um pico, juntamente com uma linha de base plana antes de prosseguir para Illumina Genome Analyzer IIx seqüenciamento. Antes de Illumina Genome Analyzer IIx sequenciação, Chia-PET DNA idealmente devem ter uma concentração mínima de 10 nM. Executar um ponto de 4-PCR quantitativo de acordo com a Illumina Guia Protocolo Quantificação qPCR para determinar a quantidade de amostra para carregar sobre a célula de fluxo. Alternativamente, realizar um um ponto-PCR quantitativo como se segue: Diluir o modelo de controle a 100 pM, 22:00 e 13:00. Conforme descrito no Illumina Protocolo Quantificação qPCR, um modelo de controle é definido como qualquer biblioteca preparada para o seqüenciamento na plataforma Illumina e deve ser o mais semelhante possível em termos detamanho modelo de conteúdo, GC e tipo de biblioteca. Diluir o DNA Chia-PET a 10 pM. Configure PCR triplicatas de cada diluição com 0,1 Primer qPCR ul 1,1, 0,1 Primer qPCR ul 2,1, 5 ul LightCycler480 DNA SYBR Green I Mix Master, 3,8 água livre de nuclease ul e 1 ml de modelo com Roche Applied Science LightCycler 480 Tempo-Real Sistema de PCR. Inclua dois controles negativos, utilizando 1 ml de água livre de nuclease como modelo. Desnaturação inicial 95 ° C 5 minutos 4,8 ° C / s Amplificação 95 ° C 10 segundos 4,8 ° C / s 60 ° C 1 minuto 2,5 ° C / s 72 ° C 30 segundos 4,8 ° C/ S Curva de fusão 95 ° C de 5 segundos de 4,8 ° C / s 65 ° C 1 minuto 2,5 ° C / s 95 ° C 5 ° C por aquisições Resfriamento 40 ° C 10 segundos 2,0 ° C / s Assegure-se que os controlos negativos não mostram nenhuma amplificação e que o desvio padrão para os valores de TC é menos do que 0,1 antes de calcular a concentração dos modelos de biblioteca com base na curva padrão gerada a partir das diluições modelo de controle. Gerar aglomerados na superfície de células de fluxo através do carregamento Illumina int 13:05o Illumina CBOT Sistema de Geração de Cluster de acordo com instruções na tela. Continuar a sequência de ADN Chia-PET no Illumina Genome Analyzer IIx usando Illumina iniciador de sequenciação 3-454 e 4-454 Illumina iniciador de sequenciação em uma única faixa de ver a qualidade da biblioteca. Armazenar restante DNA CHIA-PET a -20 ° C. Se a biblioteca tem dados bons, preparar a amostra para execuções adicionais de 4 a 8 pistas conforme necessário com base nos resultados da pista de amostra para se obter 18-20.000.000 leituras única. A quantidade de Chia-PET DNA carregado nas células de fluxo depende muito da versão do software de seqüenciamento de análise de dados, Estúdio Illumina de Controle do seqüenciamento. Para a versão 2.9, os níveis de concentração de carga de um terço à metade da capacidade máxima de cada telha, o que equivale a aproximadamente 21 milhões de passagem filtrada lê com cerca de 9,5 milhões de lê PETs. Carregamento reduzido é necessário para assegurar base de f-chamada corretaou as seqüências de códigos de barras dos linkers. Este erro ocorre quando um número elevado de nucleótidos semelhantes são sequenciadas, como é o caso se o linker é sequenciado, para obter informação de códigos de barras. Se a informação do código de barras não é desejada, e os linkers não são lidos, então a concentração de carregamento completo pode ser usado. Os arquivos convertidos qSeq pelo chamador de base offline pode ser analisada usando a ferramenta de Chia-PET de acordo com o manual de instalação Chia-PET Tool (Versão 4.1) 8. C. Representante Chia-PET Resultados Nós construído com sucesso Chia-PET bibliotecas usando a RNA polimerase II anticorpo (8WG16) em células MCF-7 (CHM160 e CHM163) 9 utilizando 672 ng de material ChIP como descrito acima. O gel de diagnóstico inicial executar desta biblioteca amplificado por PCR, como mencionado no Passo 6,2 do protocolo de Chia-PET, exibida uma banda brilhante e bem definida nao tamanho esperado de 223 pares de bases para todos ciclismo PCR utilizada (ver Figura 4). 16 ciclos de PCR foi utilizada para amplificar a biblioteca de Chia-PET e um rendimento total de 17,1 ng foi obtido. Um único, pico electroferograma intensa foi observada com o tamanho esperado de 223 pares de bases por meio de análise Agilent 1000 DNA como mencionado no Passo 7,1 do protocolo de Chia-PET (ver Figura 5). Figura 1. Resumo ChIP. Células MCF-7 são dual reticulado com EthylGlycol bis (SuccinimidylSuccinate (EGS) e formaldeído sequencialmente, resultando em ligações covalentes entre cromatina espacialmente adjacentes. A cromatina reticulada foi obtido a partir dos fixos células MCF-7 por lise celular e lise nuclear. A cromatina foi então sujeito à fragmentação de uma gama de tamanho de 200-600 pares de bases. Depois do pré-limpeza do cromatina sonicado com Proteipérolas de n G magnéticas para remover não-específico de ADN, a cromatina pré-limpos foi imunoprecipitada durante a noite com anticorpos revestidos pérolas para capturar cromatina de interesse. Figura 2. Análise em gel dos fragmentos de cromatina sonicadas. A 100 pb escada de DNA é mostrado na pista primeira e última para referência tamanho. A cromatina sonicado exibido forte intensidade entre 200 a 600 pb que é ideal para capturar as interacções de longo alcance de cromatina. Figura 3. Chia-PET visão geral. Fragmentos de cromatina são fragmentados fim-embotado e ligados a biotiniladas meias-linkers contendo sítios de restrição flanqueando CEMm. Complexos de cromatina intactas são então eluído das pérolas e submetido a ligadura proximidade sob condições extremamente diluídas, de tal modo que os fragmentos de ADN que interagem são preferentially ligado a um outro. Após reversa de ligação cruzada para remover o DNA proteínas associadas, a digestão é realizada CEMm para libertar tag-ligante-tag (PET) construções, que são então purificados por ligação selectiva aos grânulos estreptavidina. As construções de PET são ligados com adaptadores para high-throughput seqüenciamento. Figura 4. Análise em gel de Chia-TAP após amplificação por PCR. Uma escada 25 pb do DNA é mostrado na pista 1 e 5 para referência tamanho. As pistas 2 a 4 são produtos de PCR gerados após 16, 18 e 20 ciclos de amplificação por PCR a partir de 2 ul de modelo grânulo-imobilizada, respectivamente. Esta é uma biblioteca de sucesso, conforme indicado pelas brilhantes, bem definidas bandas no tamanho esperado de 223 pb. O esfregaço não-específica é gerada quando o número de ciclos de PCR é aumentada enquanto que a menor banda de cada reacção de PCR é constituído por dímeros de iniciadores. <img src= "/ Files/ftp_upload/3770/3770fig5.jpg" alt = "Figura 5" /> Figura 5. Agilent 2100 Bioanalyzer análise de purificada Illumina-454 adaptador ligado Chia-PETs. ​​Tela captura de Agilent 2100 eletroferogramas Bioanalyzer perfil de uma biblioteca bem sucedida, com um único pico intenso com o tamanho esperado de 223 pb. Note-se que o Agilent Bioanalyzer ensaio geralmente relata um tamanho ligeiramente maior do que o esperado, neste caso, o pico desejado é exibida a 237 pb, em vez de 223 pb. Isto está dentro da gama de erro de 10% do ensaio Agilent.