의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

1. GP120에 레이블 이 프로토콜에서 사용되는 형광 염료가 단백질에 바인딩을위한 효과적인 현미경 이미징을위한 충분한 사진 안정이며, 우리의 현미경으로 가능한 레이저의 여기 파장이 동일합니다. 태그 단백질에 대한 형광 분자를 선택할 때이 세 기준은 충족해야합니다. 교환 그의 gp120 DH12 (박사 마이클 조, 아이오와 주립 대학에서 선물) 원심 필터 유닛 (30 kDa MWCO)를 사용하여 멸균 PBS로 단백질 버퍼를 6 – 죽은 사람이야. gp120 농도가 1 이상 밀리그램 / ML 없습니다 있는지 확인하십시오. 참고 : 그의 6 – 태그가 다른 X4 또는 R5 열대의 종자에서 gp120 단백질은 또한 테스트되지 및 상업 면역 테크놀로지에서 구할 수 있습니다했습니다. ~ 산도 8.5과 중탄산 50mM 최종 농도를 얻기 위해 귀하의 단백질 용액에 나트륨 중탄산염 산도 9.0을 추가합니다. 디입니다 아민 반응 알렉사 형석 488 (AF488) 형광 염료를 추가10 배 어금니 과잉에 물에 ssolved. 어둠 속에서 실온에서 1~2시간이 혼합되어 알을 품다. 여분의 염료를 제거하려면 이전처럼 원심 필터 장치를 사용하여 컬럼에 신선한 멸균 PBS를 추가합니다. 모두 무료로 염료 (4 ML PBS로 3-4 세차장) 제거될 때까지이 단계를 반복합니다. gp120은 약 1 밀리그램 / ML에 집중되어 때까지 아래로 봐. 참고 : 염료는 수용성, 또는 다른 겔 여과를 사용할 수있는 경우 투석이나 원심 필터 단위로 무료로 염료를 제거하는 것은에서만 작동합니다. 분류 단백질의 단백질 (F / P)의 분자 당 형광 강도를 측정하기 위해 적절한 파장 (예를 들어, AlexaFluor 488에 대한 488 nm의시)와 단백질에 형광 염료의 농도를 (μm의에서) (우리가 사용하는 결정 다음 '단백질 및 라벨'설정)를 사용하고 NanoDrop 분광 광도계 당신에게 F / P 비율을주는이 두 숫자를 나눕니다. 동일한 절차 등 ICAM-1과 Cy5와 같은 다른 단백질과 염료에 사용됩니다. 참고 : spectroph의 다른 유형otometers는 NanoDrop를 사용할 수없는 경우 F / P 비율을 얻기 위해 단백질 농도와 형광 염료 농도를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 2. 흐름 전지 조립 및 이중층 준비 흐름 전지 및 이중층 준비를위한 일반적인 절차는 이전 14 자세히 설명되었습니다. 여기 Bioptech 흐름 셀에 그의 6 개의 태그가 gp120 DH12를 포함 bilayers를 준비하는 구체적 프로토콜을 설명합니다. 전염성 바이러 스나 감염된 세포와 관련된 연구 내용 및시기 작은 볼륨이 제한 시약, 일회용 Ibidi 흐름 챔버 (끈적 슬라이드 저는 0.2 Luer)에 의한 필요는 단계 2.4-2.9에서 동일한 이중 레이어 준비 절차와 함께 사용하고 따라야 수 있습니다. Ibidi 흐름 챔버에 대한 정보는 회사 웹사이트에서 구할 수 있습니다 http://www.ibidi.com/service/display_material/CA_8p_EN_150dpi.pdf </>. Pirhana 솔루션 (45 ML 황산 (미량 금속 학년 98%)와 15 ML 30 % 과산화수소) 14를 준비합니다. 플라스틱 클램프로 잠그다 커버는 15 분 동안 Pirhana 솔루션에 실수할. 피카 – 정화의 물로 채워진 비커에 전표를 덮어 2 분 (각 측면에서 한 분)을 위해 물을를 실행하는 아래 각 하나를 씻어 전송합니다. 마르도록 선반에 장소. 이전 14 설명된대로 Bioptechs FCSII 챔버 스를 조립. 12.5 %를 포함하는 리포좀 혼합물 니켈 2 + chelating의 lipids 16를 캡쳐하고 이중층 표면에 그의 6 gp120을 제시하기 위해 사용됩니다. 유리에 팁을 건드리지 않고 microaqueduct 슬라이드로 리포좀 혼합물의 1 μl 방울을 추가합니다. 이전 14 그림 다섯 1μl 도트가되도록 유량 셀 당 5 bilayers의 최대 준비하려면 4 번 이상까지 반복합니다. lipids의 꼭대기에서 커버 슬립을 놓습니다. 스테인레스 스틸 CL과 함께 하얀 유지 반지를 커버A 기본 단위, 이상의 모든기구를 회전시키면서 밀봉. 마커로 bilayers의 위치를​​ 표시한다. 상온에서 10 분 동안 품어. 비디오와 같이, 왼쪽 관류 관으로 양방향 꼭지와 튜브를 부착합니다. 50 ML 10X HBS [10X : 위에 3 방향 꼭지 (튜브는 이전에 인간 혈청 알부민 (HSA) (HBS / HSA가 들어있는 HEPES-버퍼 식염수 (HBS)로 꽉 찼는가있는 튜브의 끝에 긍정적인 메니 스 커스 생성 HEPES은 식염수 버퍼 : 200 밀리미터 HEPES, 산도 7.2, 1.37 M NaCl, 50 MM KCl, 2 HPO 4 나 7 밀리미터, 60 MM D-글루코오스] 20 ML 25x HSA, 500 μl 1M CaCl 2, 1 ML 1 M MgCl 2 DH는 500ml와 0.22μm 필터로 필터)에 총 볼륨을 가져올 수있는 2 0과 거품없는 상태입니다. 바로 관류 관에 튜브를 연결하고 부드럽게 흐름 전지를 통해 버퍼를 밀어. 한 ML의 주사기를 충전하고 3 방향 꼭지의 열린 부분에 부착하여 100 μm의에게 NiCl 2를 포함하는 카세 인의 ~ 300 μl로 이중층를 차단하십시오. 세대tly 통해 버퍼를 밀어하고 주사기를 해지 전에 두 stopcocks를 닫습니다. 상온에서 30 분 동안 품어. 그의 6 – 태그가 AF488-라벨 gp120을 (농도가 아니라 16 이전에 설명한 결정됩니다) 추가합니다. 우리는 HIV-1 virion의 표면 17 일에 발견된 환경을 클러스터의 로컬 밀도를 모방하는 gp120/μm 2 ~ 250 분자를 사용합니다. 이전 14 보도된 바와 같이 마찬가지로, 우리는 이중층에 ~ 250 분자 / μm의 ICAM-1의 2를 사용합니다. 카세 인 다로 유동 세포로로드합니다. 상온에서 어둠 속에서 30 분 (호일로 덮어)을 품어. 동일한 절차는 그러한 그의 12 태그를 이중층에 ICAM-1을 Cy5-라벨 등 다른 단백질을 통합하는 데 사용됩니다. 버퍼의 5 ML과 bilayers 씻으십시오. 3. FRAP 통해 Bilayers의 품질 관리 bilayers의 단백질은 laterally diffusible이어야합니다. bilayers에 세포를 추가하기 전에, 그것을 보장하는 것이 중요하다준비된 이중층에 단백질의 이동성. 여기 공촛점 현미경 스캐닝 TIRF, 넓은 필드 epifluorescence, 또는 레이저를 조명 대부분의 목적을 수동으로 수행할 수 있습니다 (FRAP) 메소드 3 Photobleaching 후 형광 복구에 대해 설명합니다. 목표는 지질 이중층, 표백제 장소 및 표백 지역 unquenched 분자의 반환을 모니터의 형광 이미지를 완벽하게 균일한 필드입니다. 이분에서 50 %의 복구가 허용있을 수 있습니다. 모든 주요 현미경 제조 업체 (Leica, 니콘, 올림푸스, 자이스 혈구)이 응용 프로그램을 위해 잘 작동 객관적으로 조명 TIRF 시스템을 판매하고 있습니다. 각 회사는 TIRF 조명 및 기타 운영 기능의 유사 콘텐츠를 제공하고 있지만, 이미지 품질은 본질적으로 동일합니다. 표백 최소화하기 위해 낮은 여기 강도를 사용하십시오. 이러한 NA 1.3-1.45 40x, 60x이나 100x와 같은 높은 수치 조리개 목표를 사용하십시오. 빛을 intens을 줄이기 위해, 표준 형광등이나 TIRF 현미경을 사용하는 경우ity는 여기 빛의 경로에 중성 농도 필터를 넣어. 대부분의 레이저 시스템은 낮은 전압으로 acusto 광학 조정할 필터 (AOTF) 또는 acusto 광학 빔 스플리터 (AOBS)를 설정하여 낮은 조명에 대해 설정할 수 있습니다. "사전 표백제"이미지를 기록합니다. 낮은 광 조건 binning 보상하기 위해 냉각 CCD 카메라를 사용하는가 2×2 또는 4×4으로 설정해야한다면, 게인을 사용할 수도 높은, 또는 긴 노출을 (초의 순서에 예를 들어)을 설정할 수 있습니다. 공촛점를 사용하는 경우, 핀홀의 조리개를 열 수 있습니다; 이득은 높은 설정하고, 느린 스캔하거나 사용하는 평균. 블리치 자리를. 표준 형광 또는 TIRF 현미경을 사용하는 경우 최대 강도 조명을 할 수 있도록 모든 ND 필터를 제거, 필드 다이어프램을 폐쇄하고 몇 초 동안 샘플을 쉽게받을 수 있습니다. 공촛점을 스캐닝 레이저를 사용, 표백 얼룩까지 8 배속까지 약 4X의 레이저 파워 최대 및 줌 설정합니다. 경우 공촛점 사용에 대한 경고 : 너무 높은 확대하지 이중층은 exces에 의해 손상될 수 있기 때문에sively 광자를 집중. 10-15초 간격, 기록 이미지는 3.1 및 3.2과 같은 조명, 녹음 설정을 사용합니다. 2-3분 안에 지점은 "사전 표백제"이미지의 접근 강도를 복구해야합니다. 빠른 복구가 성공적으로 모바일 이중층의 징조입니다. 자리가 어두운 남아있을 경우 에지가 높은 콘트라스트를 유지한다면, 특히, 형광 단백질은 이중층에 고정되어 있으며, 실험에 사용하지 않아야합니다. 참고 : 현재 현미경에서는 4 분 미만에있는 전형적인 농도에서 형광 ICAM 표백제로 닦았을 240 μm의 2 면적 원형 지점에 641 nm의 광의 0.9 MW을 제공할 수 있습니다. 독자는 30 초 미만 번 반복 방식으로 이러한 분석을 수행하기에 충분 이상입니다 표백와 HG 또는 XE 램프의 중요한 정렬을 찾습니다. 또한 추가 det에 대해 3 참조 보이겠지만ails. 4. 셀 및 Immunofluorescence 염색법의 분사 37 ° C (이것은 약 30 분 동안 노 CO 2와 37 ° C 배양기에서 할 수있는)로 흐름 전지를 워밍업. 한 ML의 주사기에 의해 활성화된 인간의 CD4 + HBS / HSA ~ 400 μl의 T 세포 (2-5×10 6 / 유동 세포)를 추가합니다. 세포가 37 ° C 배양기에서 ~ 45 분 동안 이중층에 연결하자. Ibidi의 챔버를 사용하는 경우 추가적인 버퍼마다 15-20 분를 제공합니다. 2 % paraformaldehyde를 주입하여 세포를 고정 37시 10 분 동안 품어 ° C를 1ml 실온 PBS 버퍼로 3 배 씻는다. 상온에서 5 분 동안 0.1 % 트리톤 X-100을 주입하여 세포를 Permeabilize. 방 온도 PBS 버퍼의 1ml (phosphorylated 단백질에 대해 탐색 때, 당신이 처리하는 동안 인산염 제거를 방지하기 위해 PBS에 1mM 최종 농도 또는 다른 인산 가수 분해 효소 억제제에 나트륨 vanadate를 추가할 수)로 3 배 씻는다. 에 대해 5 % 염소 혈청과 카제인을 사용하여 차단상온에서 25 분. 동물 혈청의 유형은 이차 항체에 따라 달라집니다. 상온 PBS 버퍼 1 ML로 3 배 씻는다. 상온에서 1 시간 – 30 분 ~ 300 μl 버퍼 / 흐름 세포에 일차 항체를 추가합니다. 초기 멤브레인 – 근위 활성화 신호를 감지하기 위해, 우리는 Lck 전체 또는 핀 (줏으라고) Lck phosphorylated 특정 항체를 사용합니다. 상온 PBS 버퍼 1 ML로 3 배 씻는다. 일차 항체 다로 버퍼에 적절한 fluorescently 레이블 이차 항체를 추가합니다. 실험을 위해서는 염소가 안티 토끼 중등 568-라벨 알렉사 형석을 사용합니다. 상온에서 20 분 동안 품어. PBS 버퍼 1 ML로 3 배 씻는다. 참고 : 단 이차 항체 (노 차 항체)를 취급하는 제어 이중층을 가지고 필수적입니다. 단계 4.1-4.5과 스킵 4.6에 따라 다음 단계를 4.7으로 진행합니다. 이것은 보조 항체가 아닌 특정 바인딩의 수준을 결정합니다. 양자 택일로, 하나는 직접 라벨을 사용할 수 있습니다에드 일차 항체. 5. TIRF 현미경에 의한 이미지 획득 TIRF 현미경은 250 nm의 또는 유리 기판과 셀 인터페이스에 얇은 평면에 국한 형광 신호 여기에 있습니다. 이것은 지질 이중층에서와 즉시 apposed 세포 세포막에서 불과 신호의 이미지 획득을 보장합니다. 따라서 시냅스에서 유일한 분자가 몇 군데있다. 세포의 하단에 TIRF 이미지에만 멤브레인 – 근위 영역 때문에, 지느러미 막에 internalized하거나 재배 포할되는 단백질이 발견되지 않습니다. 그런 다음 추가 표준 widefield이나 세포의 다른 볼륨에 비해 축적이나 시냅스 분야에서 단백질의 분포를 결정하는 공촛점 현미경으로 영상을 취득하는 것이 중요있을 수 있습니다. 모든 주요 현미경 제조 업체 (Leica, 니콘, 올림푸스, 자이스 혈구)이 아파트에 가서 잘 작동 객관적으로 조명 TIRF 시스템을 판매습곡. 각 회사는 TIRF 조명 및 기타 운영 기능의 유사 콘텐츠를 제공하고 있지만, 이미지 품질은 본질적으로 동일합니다. 각 TIRF 현미경은 작동을위한 자체 세부 사항을 가지고 있지만, 다음과 같은 일반적인 규칙은 고해상도 영상을 얻기 위해 적용합니다. 조명은 표백 피하기 위해 낮은 있어야합니다. 카메라는 선형적인 응답이 있어야합니다. 카메라가없고 채도와 이미징 넓은 다이나믹 레인지를 할 수 있어야합니다. 모든 설정은 정량 분석​​을위한 상수 설정되어야합니다. 6. 데이터 분석 CD4 + VS에서 gp120와 T 세포 상호 작용의 결과로 활성화된 세포 신호를 공부하려면 TIRF 이미지의 정량 분석은 이러한 활성 및 시냅스 15 모집 Lck 및 핀 등의 여부 세포 내 신호 전달 분자를 결정하기 위해 수행된다. 여기는 대부분의 이미지 분석을 위해 적용 가능한 간단한 방법을 설명이러한 ImageJ와 Metamorph 같은 응용 프로그램 패키지. 우리는 여기서 우리의 방법 12를 위해 윈도우, 매킨토시, 리눅스에서 실행 ImageJ를, 사용했다. 분석> 세트 측정 탭에서 영역에 대한 확인란을 선택하고 회색 값을 뜻합니다. 당신은 다각형 또는 프리핸드 추적 폐쇄 모양 이미지에서 관심 영역을 만들고> 측정 분석 않는 경우, 소프트웨어는 결과 테이블에서이 측정에서 데이터를 넣어 것입니다. 면적은 픽셀의 수 또는 μm의 2 것입니다. 평균은 임의 단위의 평균 강도입니다. 그것에서 빼서 배경 강도를 가지고 있어야합니다. 지역에서 평균 마이너스 배경을 배가시키는 것은 임의의 단위로 단백질의 통합 강도를 반환합니다. 민 및 영역 측정을 설정합니다. 한 실험 조건에 대한 이미지를 엽니다. 각 셀에 들어, 추적 및 이익 (의미)의 영역을 측정하고 추적 및이자 (배경)의 영역 밖에서 영역을 측정합니다. 때, 한 실험 조건으로 복사 측정 중 하나를 수행하고 Excel 또는 다른 스프레드 시트 프로그램에 붙여넣거나 측정을 저장합니다. 각 실험 조건에 대해 6.2 단계로 돌아갑니다. 측정이 완료되면 결과를 계산합니다. 수식은 다음과 같습니다 평균 강도는 = 그러니까 – 배경 통합 강도 = 평균 밀도 * 면적 7. 대표 결과 VS에서 gp120과 상호 작용의 결과로 초기 멤브레인 – 근위 신호 Lck 분자와 핀의 활성화 및 채용을 측정하기 위하여, 기본 인간의 CD4 + T 세포는 gp120과 ICAM-1 15 베어링 bilayers에 도입되었습니다. 오직 ICAM-1과 bilayers을 소개 세포는 신호의 기저 레벨을 정의하는 컨트롤을 역임했습니다. Specific 형광 강도는 ICAM-1 이중층와 상호 작용하는 세포에 대한 gp120과 ICAM-1을 포함하는 bilayers에서 그리고 전체 접촉 면적 내에서 세포에 대한 gp120 연락처 지역 내에서 측정되었다. 평균 형광 강도의 증가는 확대 수술의 흔적 모집 및 VS에 대한 신호 전달 분자의 활성화입니다. 이것은 더욱 통합 형광 강도의 비교 증가에 의해 입증됩니다. 그러나 통합 형광 강도에는 변화가 없다면,이 신호 전달 분자의 재배포를 나타냅니다. 세포가 gp120과 ICAM-1, Lck 총과 줏으라고 (Y394)를 포함하는 bilayers와의 교류 후 VS 인터페이스 채용 및 gp120 (Figs. 1 & 2)로 colocalized되었다. Lck 전체의 평균 강도 (그림 1) 혼자 ICAM-1보다 gp120과 ICAM-1을 모두 포함하는 이중층 높은했지만 통합 강도 레벨 (그림 1)과 유사했다, Lck가로 재배포되는 제안CD4 + T 세포 gp120에 대한 바인딩시 중앙 클러스터. 그러나 줏으라고 (Y394) (그림 2)의 부량은 gp120과 ICAM-1을 함유 bilayers의 평균 농도는 ICAM-1 혼자 bilayers에 그 이상의 것을 보여주었다, 그리고 통합 강도가 gp120과 ICAM 모두와 bilayers에서 더 높았다는 -1 ICAM-1 혼자 bilayers보다. 인터페이스에서 Lck 전체의 수치가 gp120과 ICAM-1과 ICAM-1 혼자 bilayers, 활성화 루프 Lck에서 잔류물 Y394의 gp120 구속력을 증가 인산화에 준수 세포에 유사하면서 이것은 나타냅니다. 반대로, 퓐 더 핀은 gp120과 ICAM-1을 모두 포함하는 bilayers보다 ICAM-1 혼자 bilayers에 세포의 접촉 영역에 존재했는데, (그림 3) VS으로 채용되지 않았습니다. 따라서, 우리는 퓐 아닌 Lck, HIV-1 gp120-유도 VS의 적극적인 키나제는 것을 결론. 그림 :시 분리막-근위 신호 HIV-1 gp120-유도 VS. 의 대표적인 세포의 이미지gp120 + ICAM-1 이중층 (상단 패널)과 ICAM-1 이중층 (하단 패널)가 표시됩니다. 그림 1의 노란 선으로 표시된 지역별로 그림과 같이 각 세포의 형광 강도는 세포 발자국 수동으로 추적 분야 내에서 계량되었다. TIRF 현미경에 의해 감지 평균 및 통합 농도의 부량는 각각 왼쪽과 오른쪽 그래프로 표시됩니다. 30-350 세포의 합계는 각 상태에 대한 계량했다. 바 = 5 μm의. 셋 반복 실험 중 하나에서 데이터가 표시됩니다. 그림 1. CD4 + T 세포는 45 분 동안 혼자 gp120과 ICAM-1 또는 ICAM-1을 포함하는 bilayers에 도입 후 고정 및 Lck 총 물들어 있었다. 그림 2. CD4 + T 세포는 이중층에 소개되었습니다s은 45 분 동안 혼자 gp120과 ICAM-1 또는 ICAM-1을 포함하고 줏으라고 (Y394)에 고정하고 묻다. 그림 3. CD4 + T 세포는 45 분 동안 혼자 gp120과 ICAM-1 또는 ICAM-1을 포함하는 bilayers에 도입 후 고정 및 총 퓐 위해 물들어 있었다.