Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

1. Enzimatik deglycosylation Buharlaşma nedeniyle su kaybını en aza indirmek için PCR tüpleri kullanın. Etiket bir set borular 1 7. Çözülme, 10X, G7 tampon, 10X glikoprotein denatüre tampon, ve% 10 NP-40 ve tüpler içeriğini karıştırmak için hafifçe dokunun. Oda sıcaklığında tutun. Buz üzerinde enzim içeren flakon yerleştirin. Erime / donma döngüleri en aza indirmek için deneyin. Ul dH 2 O 600 (150 mikrogram) hCGβ flakon içeriği çözülür ve buz üzerinde tutmak. DH 2 O 10X stok seyreltilmesi 1 ml 1X G7 tampon hazırlayın 25 ul 1X G7 tampon PNGase F 0.5 ul seyreltilir ve buz üzerinde tutmak. 2 ul α-N-Acetylgalactosaminidase her α1-2 Fucosidase, β1-3 galaktozidaz, ve α1-3, 6 galaktosidaz birleştirerek exoglycosidase (EG karışımı) karışımı hazırlayın. PCR tüpleri belirtildiği gibi ayarlayın: ak "> Boru / örnek # 1 2 3 4 5 6 7 hCGβ (0.25mg/ml) 9μl 9μl 9μl 9μl – – – 10X Glikoprotein Tampon denatüre 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl dH 2 O – – – – 9μl 9μl 9μl Tüpler kapağı, hafifçe karıştırın ve yerPCR, kapağını kapatın ve 94 az 10 dakika inkübe proteinler denatüre ° C 4 ° C tutun takip (PCR PCR tüpleri kullanılarak büyük ölçüde küçük hacimli örnekleri buharlaşmasını önler). PCR tüpleri çıkarın ve görünür bir yoğunlaşma kaldırmak için santrifüj. Belirtildiği gibi aşağıdaki reaktifler ekleyin: Örnek # 1 2 3 4 5 6 7 % 10 NP-40 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 10X G7 Tampon 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5 ve mu; L 2.5μl PNGase F 1:50. – 2μl – – 2μl – – Deglycosylation Mix – – 2μl 2μl – 2μl 2μl EG karışımı – – – 2μl – – 2μl dH 2 O 10μl 8μl 8μl 6μl 8μl 8μl 6μl Toplam reaksiyon vol. 25 μ l 25 μ l 25 μ l 25 μ l </ Td> 25 μ l 25 μ l 25 μ l Yeni kapaklar (bir inkübasyon döngüden sonra düzgün uymaz bu yana kullanılan at) kullanılarak PCR tüpleri kapatın. 4 kez hafifçe dokunarak ve ardından içeriğini aşağı doğru döndürün tüpler karıştırın. 37 ° C, 4 saat sonra 4 ° C'ye kadar örnekleri serin termalcycler ve inkübe tüpleri yerleştirin 2. Deglycosylated örneklerin SDS-PAGE 4 ul 1,25 DTT ekleyerek 130 ul taze 3X azaltarak SDS yükleme tamponu hazırlayın. Her bir örnek için hazırlanan 3X azaltarak SDS yükleme tamponu 12.5 ul ekleyin. Yeni kapaklarla kapatın ve tüpler tüpler karıştırmak için hafifçe dokunun. 94 bir PCR tüpleri inkübe ° C 4 ° C'ye kadar serin sonra 5 dakika Her numunenin 30 ul ve% 10-20 Tris-Glisin jel protein marker 10 ul yükleyin. Geri kalan kısmı 3.1 için örnek kaydedin. ColorPlus Prestained Protein Marker 10μl yükleyin. 130 volt boya ön alt jel yakın olduğu kadar oda sıcaklığında jel Electrophorese. Jel çalışması tamamlandığında, jel dökme kaldırmak ve yeterli Coomasie mavi jel kapsayacak şekilde leke küçük bir plastik kutu içine koyun. 1 saat yavaşça sallanarak jel Leke. Destain çözüm 50 ml, 30 dakika boyunca jel üç kez yıkayın. Beyaz bir ışık transilluminator'de veya tarayıcı kullanarak görüntüleri kaydedin. Alternatif olarak, bir çerçeve içinde selofan yaprak arasında jel kurulanmalıdır. 3. Pro-S Zümrüt 300 glikozile proteinler SDS-PAGE jel tespiti için 2.1 'de jel) ile paralel olarak,% 10-20 Tris-Glisin jel örneklerinin kalanı yükleyin. Yük 10 & muL ColorPlus Prestained Protein Marker. DMF ile jel Pro-Q zümrüt reaktif çözülür ve stok Fix, yıkayın hazırlamak çalışan ve Pro-S Zümrüt 300 için çözümler Oksitleyici iken kiti ile sağlanan ürün kılavuzuna aşağıdaki leke. Elektroforez tamamlandığında, dökme jel çıkarın ve bir plastik kutu içine koyun. Fix çözüm 100 ml ekleyerek ve oda sıcaklığında yavaşça sallanarak o gecede terk jel sabitleyin. Yıkama çözüm gentile ajitasyon ile oda sıcaklığında 10 ila 20 dakika için 100 ml jel yıkayın. Taze Yıkama solüsyonu ile yıkama işlemi tekrarlayın. Çözüm Oksitleyici 25 ml 30 dakika boyunca yavaşça sallanarak jel kuluçka karbonhidratlar okside. Adım 3.5 'te açıklandığı gibi jel yıkayın. Jel, 500 ul adım 3.2 'de 25 ml çözünmüş Pro-Q Emerald 300 reaktif çözüm ekleyerek taze Pro-Q Emerald 300 leke hazırlamak yıkamatampon boyama kiti sağlanan. Leke leke adım 3.8 'de hazırlanan 25 ml ekleyerek ve 90 ila 120 dakika boyunca yavaşça sallanarak karanlıkta inkübe jel. Adım 3.5 'te açıklanan iki yıkama adımları tekrarlayın. 300nm UV transilluminator'de görüntüleri kaydedin. Pro-Q Zümrüt Yeşili ile etiketli 80 kDa işaretleyici, jel prestained merdiven gösteren bir beyaz ışık resmi UV görüntü üst üste kullanın. Adım adım 3.11 Pro-Q zümrüt boyanan jel ile 2.10 'da Coomasie lekeli jel görüntüleri karşılaştırın. 4. Temsilcisi sonuçları Enzimatik deglycosylation sonra protein göç değişiklikler Şekil 2'de gösterilmiştir. PNGase F tedavi (N-glukanlardır kaldırılması, şerit 2) ve Deglycosylation Mix (artı endo-ve O-glukanlardır kaldırmak için exoglycosidases şeritli 3 PNGase F) (panel, şerit 1) kontrol örneği karşılaştırın. Daha fazla azalmaboyutu ek glycosidases (şeritli 4) sindirerek sonra görülür. Glukanlardır kaldırılır gibi kitlesel bir değişimin yanı sıra, bant sertleşti. 17 kDa işaretleyici (yıldız) altında çalışan bir grubun tamamen deglycosylated hCGβ polipeptid (16 kDa MW) temsil eder. Diğer bantlar, eksik deglycosylation veya hCGβ örnek mevcut çok sayıda tanımlanamayan proteinler (şeritli 1) kaynaklanıyor olabilir. Lanes 5 ila 7 (kontroller) glycosidases karşılık gelen bantları göstermektedir. Zümrüt Yeşili glikoprotein boyama Bu reaktif bir protein molekülünün tüm glukanlardır oksitler ve lekeleri, panel B'de gösterilmiştir. Bu nedenle hCGβ enzimatik (şeritli 4 şeritli 1) deglycosylated olarak sinyal şiddeti azalır. 3 ve 4 şeritli artık sinyal kullanılan enzimler dayanıklı glukanıdır motifler, varlığını gösterir. Protein göç aynıdır, ancak ek glycosidases 4 şeritli olarak kullanılan bir kaç ekstra şeker artıklarını ortadan kaldırırboyanma şiddeti hafif bir azalma görülebilir. Dayanıklı şeker moieties bütün protein türlerinin mevcut değildi: yoğun deglycosylated gösteren bazı gruplar, Zümrüt Yeşil (UV görüntü yok, parantez içinde) tarafından tespit edilmedi. Ek veri hCGβ heterojen glikozile olduğu sonucuna destekler. 2 şeritli üst bant birçok glukanlardır gruplar hala mevcut olduğunu gösteren, aydınlık ise daha düşük bant şeritli 2 (ok), Zümrüt Yeşili görüntü soluk. Bu veriler, fare hücrelerinde ifade rekombinant hCGβ birden fazla glycoforms 9 içerdiğini sonuca destek . Hatta aynı protein diğerleri ise bu farklı glycoforms bazı polipeptidlerin her fikir birliği sitesi ve / veya bazı glukanlardır glukanıdır almazlar glikozilasyon doğasında heterojenite nedeniyle genişletilmiş. Şekil 1.Tipik salgılanan ya da hücre-yüzey glikoprotein glikozilasyon desenler. HCGβ enzimatik deglycosylation gösteren Şekil 2 SDS-PAGE jeller. Panel A, B Paneli glikozile proteinler görünüm için Pro-Q Emerald 300 sonuçları gösterirken, bir Coomasie mavi boyanma gösterir. Örnek sayısı: 1, hCGβ kontrolü; 2, PNGase F sindirim, 3, Deglycosylation Mix sindirim; 4, Deglycosylation Mix artı exoglycosidases sindirim, numuneler 5 ila 7 (O-Glyc, O-Glycosidase reaktif kontrolleri; TBMM, β-N Acetylglucosaminidase; Gal / sikişi, β1-3 galaktosidaz, α1-3, 6 galaktozidaz, ve α1-2 Fucosidase; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase; Neu Nöraminidaz; PNGase PNGase F)