Identificación y caracterización de la glicosilación de proteínas específicas de uso de endo-y exoglicosidasas

1. Deglicosilación enzimática Use tubos de PCR para minimizar la pérdida de agua por evaporación. Etiqueta de un conjunto de tubos de 1 a 7. Descongele el tampón 10X G7, el buffer de la glicoproteína 10 veces desnaturalización, y el 10% de NP-40 y golpee suavemente los tubos para mezclar el contenido. Mantener a temperatura ambiente. Colocar los viales que contienen enzimas en el hielo. Trate de minimizar el deshielo / congelación de los ciclos. Disolver el contenido del vial hCGβ (150 mg) en 600 l de dH 2 O y mantener en hielo. Prepare 1 ml de 1X buffer del G-7 mediante la dilución de las acciones 10 veces en dH 2 O. Diluir 0,5 l de PNGase F en 25 l de amortiguación del G7 1X y mantener en hielo. Prepare la mezcla exoglycosidase (mezcla de EG) mediante la combinación de 2 l cada uno de α-N-acetilgalactosaminidasa, fucosidasa α1-2, galactosidasa β1-3, y α1-3, 6 galactosidasa. Establecer los tubos de PCR, como se indica: ak "> Tubo / de la muestra # 1 2 3 4 5 6 7 hCGβ (0.25mg/ml) 9μl 9μl 9μl 9μl – – – Inhibidores de la glucoproteína 10X Buffer desnaturalización 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl dH 2 O – – – – 9μl 9μl 9μl Tape los tubos, mezclar suavemente y colocar en eltermociclador, cierre la tapa y desnaturalizar las proteínas mediante la incubación de 10 minutos a 94 ° C, seguido de un 4 º C mantener (con tubos de PCR en un termociclador en gran medida evita la evaporación en las muestras de pequeño volumen). Retire los tubos del termociclador y se centrifuga para eliminar la condensación visible. Añadir los siguientes reactivos como se indica: Muestra # 1 2 3 4 5 6 7 10% de NP-40 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl Buffer 10X G7 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2,5 y mu; L 2.5μl PNGase F 1:50 dil. – 2μl – – 2μl – – Deglicosilación Mix – – 2μl 2μl – 2μl 2μl Mezcla de EG – – – 2μl – – 2μl dH 2 O 10μl 8μl 8μl 6μl 8μl 8μl 6μl Vol total de reacción. 25 μ l 25 μ l 25 μ l 25 μ l </ Td> 25 μ l 25 μ l 25 μ l Cerrar los tubos de PCR con tapas nuevas (deseche las que se utilizan, ya que no se ajustan correctamente después de un ciclo de incubación). Mezcle los tubos golpeando suavemente 4 veces y luego girar el contenido hacia abajo. Colocar los tubos en el termociclador e incubar a 37 ° C durante 4 horas y enfriar las muestras a 4 ° C. 2. SDS-PAGE de las muestras deglicosilada Prepare 130 l nuevo 3X tampón de carga SDS reducir mediante la adición de 4 l de 1,25 M de TDT. Añadir 12,5 l de la preparada 3X tampón de carga SDS reduciendo a cada muestra. Cerrar los tubos con tapones nuevos y golpee suavemente los tubos para mezclar. Incubar los tubos en un termociclador a 94 ° C durante 5 minutos y dejar enfriar a 4 ° C. Carga de 30 l de cada muestra y de 10 l de la proteína marcadora en un 10-20% de Tris-Glicina gel. Guarde el resto de la muestra de la parte 3.1. Cargar 10μl del marcador ColorPlus proteína prestained. La electroforesis en gel a 130 voltios a temperatura ambiente hasta que el frente tinte en la parte inferior del gel. Cuando el gel se haya terminado de ejecutarse, quitar el gel de los actores y el lugar en una pequeña caja de plástico con suficiente azul Coomasie mancha para cubrir el gel. Manchar el gel durante 1 hora con agitación suave. Lavar el gel tres veces durante 30 minutos en 50 ml de solución destain. Grabar las imágenes utilizando un transiluminador de luz blanca o un escáner. Por otra parte, el gel se puede secar entre las hojas de papel de celofán en un marco. 3. Pro-Q Esmeralda 300 para la detección de proteínas glicosiladas en geles SDS-PAGE En paralelo con el gel de 2.1), carga el resto de las muestras en un 10-20% de Tris-Glicina gel. Carga de 10 y mu; L marcador de proteína ColorPlus prestained. Mientras que el gel está ejecutando disolver el reactivo Pro-Q Esmeralda con DMF y preparar la revisión de valores, lavado y oxidantes soluciones para la Esmeralda Pro-Q 300 mancha siguiendo el manual de producto incluida con el kit. Cuando la electroforesis, retire el gel de fundición y lo coloca en una caja de plástico. Fijar el gel mediante la adición de 100 ml de la solución de Fix y dejarlo toda la noche a temperatura ambiente con agitación suave. Lavar el gel con 100 ml de la solución de lavado de 10 a 20 minutos a temperatura ambiente con agitación gentil. Repetir el lavado con solución de lavado fresca. Oxidar los hidratos de carbono mediante la incubación del gel con agitación suave durante 30 minutos en 25 ml de solución de oxidantes. Lavar el gel como se describe en el paso 3.5. Mientras que el gel es el lavado de preparar dulce Pro-Q Esmeralda 300 mancha añadiendo 500 l de la solución Pro-Q Esmeralda 300 reactivo disuelto en el paso 3.2 a 25 ml detinción de amortiguación en el kit. Tinción del gel mediante la adición de 25 ml de la mancha preparado en el paso 3.8 e incubar en la oscuridad con agitación suave durante 90 a 120 minutos. Repita los dos pasos de lavado descrito en el paso 3.5. Grabar las imágenes con un transiluminador UV a 300nm. Use el marcador de 80 kDa, que está marcado con Pro-Q verde esmeralda, a la superposición de la imagen UV a una imagen de luz blanca del gel que muestra la escala prestained. Compare las imágenes del gel Coomasie manchado en el paso 2.10 con el gel Pro-Q esmeralda teñidas de paso 3.11. 4. Los resultados representativos Los cambios en la migración de las proteínas después de deglicosilación enzimática se muestran en la Figura 2. Comparar la muestra de control (panel A, carril 1) con el tratamiento F PNGase (eliminación de N-glicanos, carril 2), y Mix deglicosilación (PNGase F, además de endo-y exoglicosidasas para eliminar O-glicanos, carril 3). Una reducción adicionalen el tamaño se ve después de digestión con glicosidasas adicional (calle 4). Además de un cambio en la masa, las bandas se agudizan como glicanos son removidos. Una banda ejecuta en el marcador de 17 kDa (asterisco) representa la totalidad deglicosilada hCGβ polipéptido (MW: 16 kDa). Otras bandas pudieran derivarse de deglicosilación incompleta o de las proteínas múltiples identificados en la muestra hCGβ (ver carril 1). Calles 5 a 7 (controles) muestran las bandas correspondientes a las glicosidasas. La tinción de la glicoproteína de verde esmeralda se muestra en el panel B. Este reactivo se oxida y manchas de todos los glicanos presentes en una molécula de proteína. Por lo tanto la intensidad de la señal disminuye a medida que hCGβ es enzimáticamente deglicosilada (calle 1 a calle 4). La señal residual en los carriles 3 y 4 indican la presencia de motivos glicanos, que son resistentes a las enzimas utilizadas. Las glicosidasas adicional que se utiliza en el carril 4 quitar unos pocos residuos adicionales de azúcar: la migración de las proteínas es el mismo, perouna ligera reducción en la intensidad de la tinción se puede ver. Fracciones resistentes al azúcar no estaban presentes en todas las especies de proteínas: algunas bandas no fueron detectados por el verde esmeralda (ausente en la imagen de los rayos UV, entre paréntesis), lo que indica que se deglicosilada ampliamente. Datos adicionales de apoyo a la conclusión de que hCGβ es heterogénea glicosilada. La banda inferior en la pista 2 (flecha) es débil en la imagen verde esmeralda, mientras que la banda superior en la pista 2 es brillante, lo que indica que los grupos de glicanos muchos todavía están presentes. Estos datos apoyan la conclusión de que hCGβ recombinantes expresadas en células de ratón contiene múltiples glicoformas 9. Estos glicoformas diferentes debido a la heterogeneidad inherente de la glicosilación en algunos polipéptidos no reciben un glicano en cada sitio de consenso y / o glicanos algunos se extienden, mientras que otros, incluso en la misma proteína que no lo son. Figura 1.Los patrones típicos de glicosilación de las glicoproteínas secretadas o de la superficie celular. Figura 2. Geles SDS-PAGE mostrando deglicosilación enzimática de hCGβ. El panel A muestra una coloración azul Coomasie mientras que el panel B se muestran los resultados de la Pro-Q Esmeralda 300 para la visualización de las proteínas glicosiladas. Número de la muestra: 1, el control hCGβ, 2, F PNGase digestión; 3, la digestión deglicosilación Mix, 4, Mix deglicosilación más exoglicosidasas digestión, las muestras de 5 a 7 son los controles de reactivos (O-Glyc, O-glucosidasa, GNA, β-N -acetilglucosaminidasa; fucosidasa Gal / FUC, β1-3 galactosidasa, α1-3, galactosidasa 6, y α1-2; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase, Neu, la neuraminidasa; PNGase; F PNGase)