זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות glycosylation ספציפי אנדו ו exoglycosidases

1. אנזימתי deglycosylation השתמש צינורות PCR כדי להקטין את איבוד המים בשל התאדות. תווית אחת מערכת של צינורות 1-7. ההפשרה חיץ G7 10X, 10X החיץ גליקופרוטאין denaturing, ושל 10% NP-40 ו לטפוח בעדינות את הצינורות כדי לערבב את תוכנו. שמור בטמפרטורת החדר. מניחים את האנזים בקבוקונים המכילים על הקרח. נסו למזער את ההפשרה / ההקפאה מחזורים. ממיסים את תכולת הבקבוקון hCGβ (150 מיקרוגרם) ב 600 μl של DH 2 O ולשמור על הקרח. הכן 1 מ"ל של חיץ 1X G7 על ידי דילול המניות 10X ב DH 2 O. מדולל 0.5 μl של PNGase F במאגר μl 25 G7 1X ולשמור על הקרח. מכינים את תערובת exoglycosidase (EG לערבב) על ידי שילוב של 2 μl כל α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, β1 Galactosidase-3, ו α1-3, 6 Galactosidase. הגדרת צינורות PCR כמצוין: AK "> Tube / מדגם # 1 2 3 4 5 6 7 hCGβ (0.25mg/ml) 9μl 9μl 9μl 9μl – – – גליקופרוטאין 10X Denaturing הצפת 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl DH 2 O – – – – 9μl 9μl 9μl שווי הצינורות, מערבבים בעדינות ומניחיםthermocycler, לסגור את המכסה לפגל את החלבונים על ידי דוגרים 10 דקות 94 ° C, ואחריו להחזיק 4 מעלות צלזיוס (באמצעות צינורות PCR ב thermocycler מאוד ומונע אידוי בדגימות נפח קטן). הסר את הצינורות מן thermocycler ו צנטריפוגות כדי להסיר כל התעבות גלוי. מוסיפים את ריאגנטים הבאים כמצוין: לדוגמה # 1 2 3 4 5 6 7 10% NP-40 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl מאגר ה-G7 10X 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5 & mu; L 2.5μl PNGase F 1:50 דיל. – 2μl – – 2μl – – Deglycosylation Mix – – 2μl 2μl – 2μl 2μl לערבב EG – – – 2μl – – 2μl DH 2 O 10μl 8μl 8μl 6μl 8μl 8μl 6μl התגובה סך vol. 25 μ l 25 μ l 25 μ l 25 μ l </ Td> 25 μ l 25 μ l 25 μ l סגור את הצינורות באמצעות PCR כובעים חדשים (להשליך את אלה המשמשים מאז הם לא מתאימים כמו שצריך אחרי מחזור אחד הדגירה). מערבבים בעדינות את הצינורות על ידי הקשה 4 פעמים ואז לסובב את התוכן כלפי מטה. מניחים את צינורות thermocycler ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לאחר מכן לקרר את דגימות עד 4 ° C. 2. SDS-PAGE של דגימות deglycosylated הכן 130 μl טרי חיץ 3X הפחתת SDS טוען ידי הוספת 4 μl של DTT 1.25M. הוסף 12.5 μl של החיץ מוכן 3X SDS הפחתת העמסה לטעום כל אחד. סגור את הצינורות עם כובעים חדשים לטפוח בעדינות את הצינורות כדי לערבב. דגירה צינורות thermocycler על 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן לצנן עד 4 ° C. טען 30 μl של המדגם כל 10 μl של הסמן חלבון על ג'ל טריס-גליצין 10-20%. שמור את שארית המדגם עבור חלק 3.1. טען 10μl של דה מרקר ColorPlus חלבון Prestained. Electrophorese את הג'ל על 130 וולט בטמפרטורת החדר עד הכניסה לצבוע קרוב לתחתית הג'ל. כאשר ג'ל סיימה ריצה, להסיר את הג'ל של השחקנים ולמקם אותו בתוך קופסת פלסטיק קטנה עם מספיק Coomasie כתם כחול על מנת לכסות את הג'ל. הכתם ג'ל למשך שעה 1 עם תסיסה עדינה. שטפו את הג'ל שלוש פעמים במשך 30 דקות ב 50 מ"ל של תמיסת destain. הקלט את התמונות באמצעות transilluminator אור לבן או סורק. לחלופין, ג'ל יכול להיות מיובש בין דפי צלופן בתוך מסגרת. 3. Pro-Q אמרלד 300 לגילוי של חלבונים glycosylated ב SDS-PAGE ג'לים במקביל הג'ל ב 2.1), עומס יתר של הדגימות על הג'ל טריס-גליצין 10-20%. טען 10 & mu; L של דה מרקר חלבון ColorPlus Prestained. בעוד הג'ל פועל לפרק את מגיב Pro-Q אמרלד עם DMF ולהכין את תקן מלאי, שטפי ואת חמצון פתרונות אמרלד Pro-Q 300 כתם הבאים במדריך מוצר המסופק עם הערכה. כאשר אלקטרופורזה תושלם, להסיר את הג'ל מתוך יצוק למקם אותו בתוך קופסת פלסטיק. תקן את הג'ל על ידי הוספת 100 מ"ל של הפתרון לתקן ולהשאיר אותו לילה בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. שטפו את הג'ל עם 100 מ"ל של הפתרון לשטוף עבור 10 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר בהתרגשות גוי. חזור על לשטוף עם פתרון לשטוף טריים. לחמצן את הפחמימות על ידי דוגרים את הג'ל עם תסיסה עדינה במשך 30 דקות ב 25 מ"ל של חמצון פתרון. שטפו את הג'ל כמתואר בשלב 3.5. בעוד הוא ג'ל כביסה להכין טרי Pro-Q אמרלד 300 כתם על ידי הוספת 500 μl של הפתרון Pro-Q 300 מגיב אמרלד מומס צעד 3.2 ל 25 מ"ל שלמכתים חיץ המסופק בערכה. הכתם ג'ל על ידי הוספת 25 מ"ל של הכתם מוכן בשלב 3.8 ו דוגרים בחושך עם תסיסה עדינה במשך 90 עד 120 דקות. חזור על שני השלבים המתוארים לשטוף צעד 3.5. הקלט את התמונות עם transilluminator UV ב 300nm. השתמש בסמן 80 kDa, אשר מסומן עם Pro-Q אמרלד גרין, לחפוף את התמונה UV לתמונה אור לבן של הג'ל המציגה את הסולם prestained. השווה את התמונות של הג'ל מוכתם Coomasie בשלב 2.10 עם ג'ל האזמרגד Pro-Q מוכתם משלב 3.11. 4. נציג תוצאות השינויים הגירה חלבון לאחר deglycosylation האנזימטית מוצגות באיור 2. השווה את מדגם הביקורת (לוח א ', מסלול 1) עם הטיפול F PNGase (הסרת N-glycans, מסלול 2), מערבבים Deglycosylation (PNGase F; פלוס אנדו ו exoglycosidases להסיר O-glycans, מסלול 3). הפחתה נוספת לאבגודל נתפס לאחר עיכול עם glycosidases נוספים (מסלול 4). מלבד שינוי המוני, להקות להיות חדה כמו glycans יוסרו. הלהקה פועלת תחת סמן 17 kDa (כוכבית) מייצג את (MW: 16 KDA) deglycosylated מלא hCGβ פוליפפטיד. להקות אחרות שאולי נובעות deglycosylation שלם או את החלבונים מזוהה מרובים הנוכחי במדגם hCGβ (ראה מסלול 1). Lanes 5-7 (שולטת) להראות את להקות המתאימים glycosidases. מכתים גליקופרוטאין ידי אמרלד גרין מוצג בלוח זה ב מגיב oxidizes וכתמים כל glycans נוכח מולקולת חלבון. לכן עוצמת האות יורדת ככל hCGβ הוא deglycosylated enzymatically (מסלול 1 לנתיב 4). האות שיורית במסלולים 3 ו -4 להעיד על נוכחות של מוטיבים glycan, אשר עמידים בפני אנזימים בשימוש. Glycosidases נוספים המשמשים במסלול 4 להסיר שאריות כמה סוכר נוסף: ההגירה חלבון זהה, אבלירידה קלה בעוצמה של מכתים ניתן לראות. Moieties סוכר עמיד לא נכחו כל מיני חלבון: כמה להקות לא היו מזוהים על ידי אמרלד גרין (נעדר בתמונה UV, בסוגריים), המציין שהם deglycosylated בהרחבה. נתונים נוספים תומכים למסקנה hCGβ glycosylated הוא הטרוגני. הלהקה נמוך על מסלול 2 (חץ) הוא קלוש על התמונה אמרלד גרין, בעוד הלהקה העליון על מסלול 2 הוא בהיר, המציין כי הרבה קבוצות glycans עדיין קיימות. נתונים אלו מחזקים את המסקנה כי hCGβ רקומביננטי לידי ביטוי בתאים העכבר מכיל glycoforms מספר 9. אלה glycoforms שונים הן בשל ההטרוגניות הטבועה glycosylation שם כמה פוליפפטידים לא מקבלים glycan בכל אתר הסכמה ו / או כמה glycans מורחבות וחלקם אפילו על אותו חלבון לא. באיור 1.Glycosylation דפוסים אופייניים המופרשים או גליקופרוטאינים על פני קרום התא. 2. איור SDS-PAGE ג'לים מראה deglycosylation האנזימטית של hCGβ. לוח מראה כתמים כחולים Coomasie תוך לוח B מראה את התוצאות של Pro-Q אמרלד 300 עבור להדמיה של חלבונים glycosylated. מספר דוגמאות: 1, שליטה hCGβ; 2, PNGase F העיכול; 3, מערבבים העיכול Deglycosylation: 4, מערבבים Deglycosylation פלוס עיכול exoglycosidases, דגימות 5-7 הם שולטת מגיב (O-Glyc, O-Glycosidase; GNA, β-N -Acetylglucosaminidase; Fucosidase גל / Fuc, β1-3 Galactosidase, α1-3, 6 Galactosidase ו α1-2; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase; Neu, neuraminidase; PNGase; F PNGase)