Imagen cuantitativa de linaje específico Toll-like receptor-mediada por la señalización en los monocitos y células dendríticas de pequeñas muestras de sangre humana
Summary
Se describe el uso de la tecnología IMAGESTREAM (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> Www.amnis.com</a>), Que combina la citometría de flujo cuantitativa simultánea con imágenes de alta resolución digital, para cuantificar los mecanismos celulares de las células inmunes primarias de cohortes de pacientes bien definidas. Nuestros estudios proporcionan un modelo para las investigaciones traslacionales para cuantificar las respuestas específicas de linaje celular en pequeñas muestras de cohortes de sujetos.
Abstract
Las variaciones individuales en el estado inmunológico determinar las respuestas a la infección y contribuyen a la severidad de la enfermedad y los resultados. El envejecimiento se asocia con una mayor susceptibilidad a las infecciones virales y bacterianas y la disminución de la capacidad de respuesta a las vacunas con una disminución bien documentada en la humoral, así como mediada por células respuesta inmune 1,2. Recientemente, hemos evaluado los efectos del envejecimiento sobre los receptores tipo Toll (TLR), los componentes clave del sistema inmune innato que detectan la infección microbiana y de disparo antimicrobianos respuestas de defensa del huésped 3. En una gran cohorte de donantes humanos sanos, mostró que los monocitos de sangre periférica de la tercera edad han disminuido expresión y función de los TLR ciertos 4 y similares niveles de reducción de TLR y respuestas de señalización en las células dendríticas (DC), células presentadoras de antígenos que son fundamentales en el el vínculo entre la inmunidad innata y adaptativa 5. Hemos demostrado la desregulación de TLR3 en los macrófagos unad menor producción de IFN por países en desarrollo procedentes de donantes de edad avanzada en respuesta a la infección con el virus del Nilo Occidental 6,7.
De suma importancia para nuestra comprensión de la inmunosenescencia y para la intervención terapéutica es una comprensión detallada de determinados tipos de células que responden y el mecanismo (s) de la transducción de señales. Los estudios tradicionales de la respuesta inmune a través de imágenes de células primarias y de topografía marcadores celulares por citometría de flujo o inmunoblot han avanzado de manera significativa nuestra comprensión, sin embargo, estos estudios se limitan generalmente técnicamente por el pequeño volumen de muestra a disposición de los pacientes y la incapacidad para llevar a cabo complejas técnicas de laboratorio en múltiples muestras humanas. IMAGESTREAM combina con la citometría de flujo cuantitativa simultánea de imágenes de alta resolución digital y por lo tanto facilita la investigación en poblaciones de células múltiples simultáneamente para una captura eficiente de la susceptibilidad del paciente. Aquí se demuestra el uso de IMAGESTREAM en países en desarrollo para evaluar TLR7 / 8mediada por la activación de los aumentos en la fosforilación y translocación nuclear del factor de transcripción clave, NF-kB, que inicia la transcripción de numerosos genes que son críticos para la respuesta inmune 8. Utilizando esta tecnología, también hemos demostrado recientemente una alteración previamente desconocida de TLR5 y la vía de señalización de NF-kB en los monocitos de donantes mayores que pueden contribuir a la capacidad de respuesta inmune alterada en el envejecimiento 9.
Protocol
Discussion
Los pasos críticos en el uso de IMAGESTREAM para los estudios de traducción son la selección de los grupos de comparación relevantes y la optimización y validación de la especificidad del anticuerpo. Las diferencias entre los grupos de sujetos en el objetivo marcado será fácilmente evidente a través de histogramas y las imágenes de células. En combinación con un análisis exhaustivo de los cambios en los receptores relevantes y vías de señalización, estos datos proporcionan información valiosa sobre los …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por el NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089992, y el Programa de la CNRR / GCRC M01-RR00125). Los autores declaran no tener conflictos de intereses financieros y gracias al doctor Mark Shlomchik, director del Fondo para la célula de Yale Core Clasificador.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848 |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
| BD Perm/Wash | BD Biosciences | 554723 |
| CD14-PE | eBioscience | 12-0149-41 |
| CD4-PacBlue | BD Pharmingen | 68436 |
| Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC | BD Biosciences | 340546 |
| CD11c-PE | BD Biosciences | 347637 |
| CD123-PE | BD Biosciences | 340545 |
| rabbit anti-NF-κB (p65) | SantaCruz | SC-372 |
| Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21246 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| ImageStream X | Amnis |
Table 1. Specific reagents and equipment.
| Cell type | FITC | PE | Alexa 647 | PacBlue |
| Monocyte | CD14 | NF-κB (p65) | ||
| mDC | Lin1 | CD11c | NF-κB (p65) | CD4 |
| pDC | Lin1 | CD123 | NF-κB (p65) | CD4 |
Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways
Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.
References
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).
- Shaw, A. C. Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging. Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
- van Duin, D. Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression. J. Immunol. 178, 970-975 (2007).
- Panda, A. Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response. J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).
- Kong, K. -. F. Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly. J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).
- Qian, F. Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus. J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).
- Hayden, M. S., Ghosh, S. NF-kappaB in immunobiology. Cell research. 21, 223-244 (2011).
- Qian, F. Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly. Aging Cell. 11, 104-110 (2011).
- George, T. C. Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow. Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).
