Imagem quantitativa da linhagem específica Toll-like receptor-mediados sinalização em monócitos e células dendríticas a partir de pequenas amostras de sangue humano
Summary
Descrevemos uso da tecnologia de ImageStream (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> Www.amnis.com</a>), Que combina a citometria de fluxo quantitativa simultânea com alta resolução de imagem digital, para quantificar os mecanismos celulares primárias de células imunes de coortes bem definidas do paciente. Nossos estudos fornecem um modelo para investigações de translação para quantificar linhagem específica respostas celulares em pequenas amostras de coortes de indivíduos.
Abstract
As variações individuais no estado imunitário determinar as respostas à infecção e contribuir para a gravidade da doença eo resultado. O envelhecimento está associado com um aumento da susceptibilidade a infecções virais e bacterianas e diminuiu a capacidade de resposta para vacinas com um declínio bem documentado na humoral assim como mediada por células 1,2 respostas imunes. Recentemente, avaliou os efeitos do envelhecimento sobre receptores Toll-like (TLRs), os principais componentes do sistema imune inato que detectar a infecção microbiana e desencadear respostas de acolhimento de defesa antimicrobianos 3. Em uma grande coorte de doadores humanos saudáveis, nós mostramos que os monócitos do sangue periférico de idosos têm diminuição da expressão e função de determinados TLRs 4 e semelhantes níveis reduzidos TLR e respostas de sinalização em células dendríticas (DCs), células apresentadoras de antígeno que são fundamentais na a ligação entre a imunidade inata e adaptativa 5. Nós mostramos desregulação do TLR3 em macrófagos umad menor produção de IFN por DCs de doadores idosos em resposta à infecção com o vírus do Nilo Ocidental 6,7.
Primordial para nossa compreensão da imunossenescência e à intervenção terapêutica é um entendimento detalhado dos tipos de células específicos em resposta e do mecanismo (s) de transdução de sinal. Estudos tradicionais de respostas imunes através de imagens de pilhas e marcadores de células de levantamento por FACS ou immunoblot têm avançado significativamente a nossa compreensão, no entanto, estes estudos são geralmente limitados tecnicamente pelo pequeno volume de amostra disponível a partir de pacientes e da incapacidade de realizar técnicas laboratoriais complexas em vários amostras humanas. ImageStream combina citometria de fluxo quantitativa simultânea com alta resolução de imagem digital e, assim, facilita investigação em populações de células múltiplas contemporaneamente para uma captura eficiente do susceptibilidade do paciente. Aqui temos demonstram o uso de ImageStream em DCs para avaliar TLR7 / 8activação mediada-aumentos na fosforilação e translocação nuclear de um factor de transcrição de chave, NF-kB, a qual inicia a transcrição de numerosos genes que são críticas para as respostas imunes 8. Usando esta tecnologia, temos também demonstrou recentemente uma alteração previamente não reconhecido de TLR5 sinalização e na via de NF-kB em monócitos de doadores mais velhos que possam contribuir para a resposta imune alterada no envelhecimento 9.
Protocol
Discussion
Os passos críticos no uso de ImageStream para estudos translacionais são a seleção de grupos de comparação relevantes e otimização e validação da especificidade do anticorpo. As diferenças entre os grupos de indivíduos no alvo marcada serão facilmente aparentes através de histogramas e imagens de células. Em combinação com uma análise aprofundada das alterações nos receptores e vias de sinalização relevantes, estes dados fornecerá informações valiosas sobre os mecanismos que estão subjacentes a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089992, e do Programa NCRR / GCRC M01-RR00125). Os autores declaram qualquer conflito de interesse financeiros e agradecer ao Dr. Mark Shlomchik, diretor do Núcleo Facilidade Yale celular Sorter.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848 |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
| BD Perm/Wash | BD Biosciences | 554723 |
| CD14-PE | eBioscience | 12-0149-41 |
| CD4-PacBlue | BD Pharmingen | 68436 |
| Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC | BD Biosciences | 340546 |
| CD11c-PE | BD Biosciences | 347637 |
| CD123-PE | BD Biosciences | 340545 |
| rabbit anti-NF-κB (p65) | SantaCruz | SC-372 |
| Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21246 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| ImageStream X | Amnis |
Table 1. Specific reagents and equipment.
| Cell type | FITC | PE | Alexa 647 | PacBlue |
| Monocyte | CD14 | NF-κB (p65) | ||
| mDC | Lin1 | CD11c | NF-κB (p65) | CD4 |
| pDC | Lin1 | CD123 | NF-κB (p65) | CD4 |
Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways
Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.
References
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).
- Shaw, A. C. Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging. Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
- van Duin, D. Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression. J. Immunol. 178, 970-975 (2007).
- Panda, A. Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response. J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).
- Kong, K. -. F. Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly. J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).
- Qian, F. Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus. J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).
- Hayden, M. S., Ghosh, S. NF-kappaB in immunobiology. Cell research. 21, 223-244 (2011).
- Qian, F. Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly. Aging Cell. 11, 104-110 (2011).
- George, T. C. Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow. Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).
