Methoden zur intravenösen Selbstverwaltung in einem Maus-Modell

Ein. Tierhaltung und Akklimatisation Procedures Männliche und weibliche CD-1-Mäuse werden mit gleichgeschlechtlichen Geschwistern, bis zu 5 Tiere pro Käfig, in Standard-Kunststoff-Käfige mit beta-Chip Bettwäsche und nestlet Pads, mit Drahtgitter Deckel zu Wasserflaschen und Nahrungsmittel aufnehmen untergebracht. Standard Maus Futter und Wasser zur Verfügung ad libitum in den Heimatkäfige während des gesamten Experiments. Mäuse werden auf einem Rückwärts-Hell-Dunkel-Zeitplan (Lichter von 22.00 bis 10.00 Uhr) gehalten. Mäuse werden darf, um den Test IVSA Räume für eine Woche vor dem Beginn der experimentellen Verfahren zu gewöhnen. 2. Operant Ausbildung Alle Verhaltensstörungen Verfahren einschließlich gesüßte Milch Ausbildung und intravenösen Drogenkonsum Selbstverwaltung Sessions werden mit operante Kammern messen 15,9 x 14 x 12,7 cm, mit 2 ultra-sensitive Maus Hebel, Löffelstiel Tassen, Stimulus-Lichter und Mikroliterspritze Pumpen (Med Association ausgestattet ist, durchgeführtAtes Inc., St. Albans, VT, USA). Kammern sind eine Schnittstelle zu einem Computer mit Med Associates Smart-CR-Schnittstelle und Med-PC-Software, um den Zeitplan der Bewehrung programmieren und Daten sammeln. Naive Mäuse werden zu den operante Kammern gewöhnt und geschult, um Handhebelpresse mit einem gesüßte Milch Belohnung (0,1 ml) in einer Schöpfkelle Cup vorgestellt. Operant Milch Training wird in 1-stündigen Sitzungen für 5-7 Tage durchgeführt. Fertigstellung der festen Verhältnis (FR) auf dem Zeitplan Wirkhebel resultierte in der Darstellung der Löffelstiel Tasse und die Beleuchtung von einem Reiz Licht. Die gesüßte Milch bestand aus Saccharose (10 mg / ml, ACS-Reagenz, Sigma-Aldrich Co. St. Louis MO, USA) zugegeben, um Vollmilch (Fettgehalt 3,25%). Operante Ausbildung mit einer gesüßten Milch Lösung oder einer flüssigen Lebensmittels Ansporner ist eine übliche Technik zur Erleichterung operante reagiert bei Mäusen 1,2. 3. Vorbereitung der Ausrüstung, die während der Operation eingesetzt werden Required Ausrüstung – 20, 23 und 26 Gauge Nadeln, Schleifer, 1 cc Spritzen, Tygon-Schlauch, Lötkolben, Heparin, Antibiotika und Schmerzmittel. Vorbereiten einer Nadel, um das Einführen des Katheters in die Vena jugularis leiten durch Rasieren unten eine 20 Gauge-Nadel. Der Schaft der Nadel nach unten mit einer Schleifmaschine, um einen Kanal innerhalb der Nadel, um den Katheter-Schlauch in die Vene zu leiten bilden rasiert. Die Nadel Kanal sollte sorgfältig auf Metallabrieb, die hinterlegt haben überprüft werden. Etwaige Hindernisse in den Kanal sollte mit feinen Spitzen Pinzette abgeschabt werden. Passen zwei 1-cc Spritzen zum Spülen und Prüfen des Katheters verwendet werden. Planen zwei Spritzen von unter 12 cm Stücke Tygon-Schläuche und befestigen sie an einem Ende mit 26 Gauge Nadeln befestigten 1 cc Spritzen, und Strecken der anderen Enden des Schlauches über 23 Gauge Nadeln. Eine Spritze ist mit 0,9% steriler Kochsalzlösung und das andere mit einem heparinisierten Ticarcillin Lösung (33 mg Ticarcillin auszufüllenund 0,3 mg Heparin pro 10 ml steriler Kochsalzlösung). Bereiten Katheterkanüle caps. Tygon-Schläuche über eine 23-Gauge-Nadel gespannt und geschnitten 1 cm von der Fase. Schmelzen des offenen Endes der Röhre um eine dicke Dichtung zu schaffen. Der Schlauch sollte geschmolzen, so dass der gesamte Kanülenkappe lang genug, um über den Katheter Kanüle zu passen, der mit dem abgedichteten Endanschlußstück eng über das Ende der Kanüle ist. Beachten Sie, dass, wenn die Kappe zu lang ist, besteht die Gefahr, dass es gebogen wird und anschließend durchbohrt während des Anbringen des aufschraubbaren Katheters bedeckt. Somit sorgfältige Vorbereitung der Katheter Kappen wird empfohlen, um einen guten Sitz an der Kanüle bereitzustellen. Das benötigte Lösungen. Alle Reagenzien werden von Sigma-Aldrich Inc. (St-Louis MO, USA) erworben. Heparinisiertem Ticarcillin Lösung für Katheter Spülung – Man löst 0,33 g Ticarcillin (Dinatriumsalz) und 0,003 g Heparin in 10 ml steriler Kochsalzlösung. 0,03 ml der Lösung durchspült wird through der Katheter täglich. Die Antibiotika-Lösung verabreicht wird, um Blutgerinnseln und Infektionen aus Entwicklungsländern zu verhindern. Amikicin (Antibiotikum) zur subkutanen Injektion – Eine einzelne subkutane Injektion wird nach der Operation in einer Dosis von 10 mg / kg, um postoperative Infektionen zu verhindern gegeben. Ketoprofen (Analgetikum) zur subkutanen Injektion – Eine einzelne subkutane Injektion wird nach der Operation in einer Dosis von 5 mg / kg jede post-operativer Schmerzen Verwaltung gegeben. 4. Katheter Implantation Chirurgie Erforderliche Geräte und Reagenzien: Isofluran, sterile Kochsalzlösung, Alkohol (70%), 1 und 3 cc Spritze mit steriler Kochsalzlösung, 1-cc angepasst Spritzen, Antibiotika und Analgetika Lösungen in Abschnitt 3, Maus Katheter (CamCaths, Cambridgeshire, UK vorbereitet gefüllt ), Katheter Abdeckungen (Kristall Kappen von HRS Scientific, Montreal, Quebec), Auge Schmiermittel, 4 cm Kunststoff-bar zu Vene erhöhen (dieskann aus einem Kunststoff Q-tip), Polysporin, sterile Tupfer und Gaze, geraden und gebogenen Pinzette, Arterienklemmen, feinen Schere gebaut werden. Mit aseptischer Standardtechniken die chirurgische Bank, die chirurgischen Instrumente und die Katheter werden vor der Operation sterilisiert. Ordnungsgemäße Sterilisation Techniken umfassen Dampfautoklaven für die chirurgischen Instrumente und Katheter aus CamCaths gekauft. Glasperle Sterilisation kann auch an den Spitzen der chirurgische Instrumente verwendet werden. Sterilisation mit Ethylenoxid auf zarter Kathetern oder Materialien, die Gefahr Schmelzen eingesetzt werden. Eine detailliertere Beschreibung von Nagetier chirurgischen aseptischen Techniken sind in dem beigefügten Artikeln 1,2 gefunden werden. Einrichten der Bank, wird Instrumente und Nasenkonus für Wartung Narkose auf dem Foto dargestellt. Mäuse sind narkotisiert mit Isofluran-Gas und gewartet werden unter Narkose mit einem Atemschlauch unter einem Spülsystem. Augensalbe (Tränen Naturale PM) ist mit beiden Augen aufgetragen, um sie vor Austrocknung während des Verfahrens zu vermeiden. Eine entsprechende chirurgische Marge ist auf den Rücken des Tieres und um den Hals rasiert. Bevor irgendwelche Einschnitte gemacht werden, werden die chirurgischen Bereiche beschränkt mit sterilen Tüchern. Um den Katheter zum Einführen in den rechten Vorhof des Herzens herzustellen, wird das überschüssige Katheterschlauch aus 1,2 cm von der Birne des Katheters geschnitten. Dies ist die optimale Länge für erwachsene CD-1 Mäuse, etwa 8 Wochen alt, 20-25 Gramm Körpergewicht etabliert. Die Länge des Katheterschlauchs kann eventuell geringfügig angepasst werden (durch Probieren), bezogen auf den Stamm, der Größe und dem Alter der Mäuse. Vor dem Einführen wird die Spritze mit steriler Kochsalzlösung (Abschnitt 3.2) an den Katheter Kanüle befestigt ist, und der Katheter wird gespült und auf Dichtheit zu überprüfen. HaltenDiese Spritze an den Katheter während des chirurgischen Verfahrens befestigt. Es wird verwendet, um den Katheter spülen, und zurück Blut im Schritt 4,7 werden. Nach der Sterilisation mit 70% Alkohol, wird eine 2 cm lange Inzision midscapular hergestellt ab der Mitte auf der Rückseite und endet knapp unterhalb des Halses, um die Basis des Katheters aufzunehmen. Bindegewebe sollte neben mit einer Pinzette gezwungen werden, um Platz für den Katheter Basis unter der Haut zu machen. Platzieren das Tier auf dem Rücken, einen zweiten flachen 1 – 2 cm Diagonale Schnitt wird aus dem rechten Schlüsselbein gehen nach oben, um den Tieren Kiefers gemacht, nachdem das Gebiet mit 70% Alkohol abgetupft. Die Vena jugularis wird oberflächlich unter der Haut des Halses gefunden werden. In Vorbereitung für das Einführen des Katheters wird Schläuchen von der Basis des Katheters durch den Einschnitt an der Rückseite gezogen und brachte nahe der Jugularvene, indem der Schlauch unter der Haut nur über die rechte Schulter. Das Ende des Katheterschlauchs istdann zu einer Arterienklemme angebracht und platziert an der Seite des Tieres zu halten es fest. Die rechte Jugularvene wird durch leichtes wegbewegt oberflächlichen Binde-und Fettgewebe aus dem Einschnitt um den Hals des Tieres befindet. Bindegewebe um die Vene wird neben den gebogenen Pinzette gebrochen und die Vene wird dann erhöht mit einer sterilen Kunststoff-bar. Lockeren, offenen Naht Knoten sind um jedes Ende der Vene vorgenommen und der Katheter-Schlauch wird über die obere Knoten eingefädelt und über das geschlungen Nahtfaden zu ruhen über die rechte Schulter ausgespannt. Vor dem Einsetzen sowohl der nassen 20 Gauge Einführnadel und Vene mit einer sterilen Kochsalzlösung, um die Reibung zu reduzieren. Die Nadel wird parallel zu der Vene gehalten und vorsichtig in der Nähe der Unterseite des erhöhten Vene (Anmerkung: etwa 0,5 cm von der Nadelspitze braucht, um die Vene eintreten) eingesetzt ist. Mit einer Pinzette, schieben Katheterschlauch entlang der Schaft der Nadel in die Vene. Widerstand würde anzeigen, dass der Schlauch is innerhalb Bindegewebe und nicht innerhalb der Vene. Schieben 0,03 cc Kochsalzlösung durch die Vene um sicherzustellen, dass keine Lecks vorhanden sind. Leaks würde bedeuten, dass die Vene durchstochen werden oder dass der Katheterschlauch Platzierung muss justiert werden. Hinweis: Um zu überprüfen, ob der Schlauch in der Vene, versuchen Sie, ziehen Sie etwas Blut mit Hilfe des beiliegenden Kochsalzlösung Spritze. Wenn das Blut nicht sofort gezogen werden, so kann die Vene oder Herzwand werden Verschließen der Katheterspitze oder die Vene wurde nicht durchbrochen; stellen Sie die Schläuche und versuchen Sie es erneut. Needle Wiedereingliederung kann es notwendig sein, wenn Blut kann immer noch nicht aufgestellt werden. Um den Katheter zu fixieren, drücken Sie den Katheter Glühlampe zum Einfügepunkt und entfernen Sie die Nadel. Binden Sie die unten Knoten und ziehen Sie dann den Katheter bündig an der Bar, bevor binden den zweiten Knoten direkt über der Lampe. Wiederholen Sie den Test, um zu sehen, ob Blut aufgestellt werden kann und lösen Sie die Knoten leicht, wenn nötig. Tuck die Katheterschlauchs unter der Haut und Nahtmaterialdas ventrale Schnitt um den Hals des Tieres. Anwenden Polysporin Heilen Schnelle mit einem sterilen Wattestäbchen oder andere antibiotische Salbe vorzugsweise etwas Analgetikums in die geschlossene Einschnitt. Mit dem Tier auf seinen Bauch, den Katheter zu platzieren Basis unter der Haut des Rückens in den vorbereiteten Einschnitt. Stellen Sie sicher, dass das überschüssige Schlauch minimal geschlungen ist und gut unter dem Katheter Standfuß versteckt, um die Chancen des Tieres Kauen und Durchstechen zu minimieren. Vernähen den Einschnitt auf beiden Seiten des Katheters Base und gelten Polysporin Korrigieren Schnelle mit einem sterilen Wattestäbchen. Spülen Sie den Katheter mit 0,03 cc des heparinisierten Ticarcillin Lösung mit der Spritze mit dem Schlauch versehen sein (siehe Abschnitt 3.2). Verschließen Sie die Kanüle mit dem Kunststoffkanüle Schutzkappe und Schraube auf dem weißen Katheter Abdeckung. In einigen Mäusen, die frisch aus Chirurgie sind, kann Blut austreten des Katheters vor der Kanüle begrenzt. Es ist wichtig, um wieder bündig das Tier und rapidly ersetzen die Kanüle ab, bevor Blut hat die Chance heraus zu fließen. Die Tiere müssen auf einer täglichen Basis, um Katheter Durchgängigkeit aufrechtzuerhalten gespült werden. Nach Abwischen des Injektionsbereich zwischen den Tieren Hinterbeine mit 70% Ethanol, subkutan zu injizieren die analgetische Ketoprofen in einer Dosis von 5 mg / kg auf einer Seite, und das Antibiotikum amikicin bei einer Dosis von 10 mg / kg an der anderen Seite. Nach der Narkose abgesetzt wird, werden die Tiere erlaubt, in einem sauberen Käfig mit einfachem Zugang zu Nahrung und Wasser für 5 bis 7 Tage erholen. Mäuse sollten in einem Wärmeschrank über Nacht zu postoperativen Hypothermie zu verhindern platziert werden. 5. Behavioural testing – Intravenöse Selbstverwaltung Vor Verhaltenstests Katheter werden mit 0,9% sterile Kochsalzlösung gespült. Mäuse werden dann platzierend in den Kammern Operant ist und mit den Infusionsleitungen und Infusionspumpen. Aktive Hebelpressen führen in einem 3,2 sec 18 ul Arzneimittelinfusion mit der Beleuchtung eines Reizes Licht gekoppelt. Jeder Hebel Presse wird durch einen 8 sec. Auszeit Zeitraum, in dem der Reiz Licht bleibt gefolgt. Nach der operante Sitzung werden die Mäuse Katheter mit dem heparinisierten Ticarcillin Lösung, bevor sie an ihrem eigenen Käfig wieder gespült. Mäuse werden läßt 3 aufeinanderfolgenden 2-hr-Sitzungen für jede Dosierung selbst verabreichen. Die Dosen wurden in einer zufälligen Reihenfolge für jede Maus dargestellt, wie im folgenden Abschnitt gezeigt. Katheter Durchgängigkeit wird täglich, indem sichergestellt wird, dass sowohl die Kochsalzlösung und Antibiotika-Lösung durch den Katheter gespült werden beurteilt. Darüber hinaus kann ein Ketamin / Midazolam Test durchgeführt wie in der beigefügten Referenz 5 beschrieben. Kurz gesagt, Anzeichen von Anästhesie wie Unbeweglichkeit innerhalb von 5 sec eines Aufgusses von 0,02-0,03 ml Ketamin (15 mg / ml),oder Midazolam (0,75 mg / ml) Midazolam ist ein Beweis für ein Patent Katheter 5.