Dissectie van volwassen muis Utricle en Adenovirus-gemedieerde Ondersteunende-cel infectie
Summary
Mechanosensorische haarcellen zijn de receptor cellen van het binnenoor. De meest kenmerk<em> In vitro</em> Modelsysteem van volwassen zoogdier haarcellen maakt gebruik van orgaan culturen van utricles van volwassen muizen. We presenteren de dissectie van de volwassen muis utricle, en tonen we aan adenovirus-gemedieerde infectie van ondersteunende cellen in gekweekte utricles.
Abstract
Gehoorverlies en evenwichtsstoornissen worden vaak veroorzaakt door de dood van mechanosensorische haarcellen, die de receptor cellen van het binnenoor. Omdat er geen cellijn die naar tevredenheid is zoogdier haarcellen, onderzoek naar haarcellen is gebaseerd op primaire orgaan culturen. De beste kenmerk vitro modelsysteem van volwassen zoogdieren haarcellen gebruikt orgaankweken van utricles van volwassen muizen (figuur 1) 1-6. De utricle is een vestibulaire orgaan, en de haarcellen van het utricle zijn vergelijkbaar in zowel structuur als functie om de haarcellen in het gehoororgaan, het orgaan van Corti. De volwassen muis utricle voorbereiding is een volwassen sensorische epitheel voor de studie van de moleculaire signalen die het overleven, homeostase, en de dood van deze cellen te reguleren.
Zoogdieren cochleaire haarcellen zijn terminaal gedifferentieerd en niet wordt geregenereerd wanneer ze verloren zijn. In niet-mamMalinese gewervelde dieren, auditieve of vestibulaire haar celdood wordt gevolgd door robuuste regeneratie die gehoor en evenwicht functies 7, 8 herstelt. Hair celregeneratie wordt gemedieerd door glia-achtige ondersteunende cellen, die de basolaterale oppervlak van haarcellen contact op te nemen in de sensorische epitheel 9, 10. Ondersteunende cellen zijn ook belangrijke mediatoren van haar overleving van de cel en de dood 11. We hebben onlangs een methode voor infectie van cellen in cultuur ondersteunen utricles met adenovirus. Met adenovirus type 5 (dE1/E3) een transgen met GFP onder de controle van de CMV promoter leveren wij dat adenovirus specifiek en efficiënt infecteert ondersteunende cellen. Steun cel infectie-efficiëntie ongeveer 25-50% en haarcellen niet geïnfecteerd (figuur 2). Belangrijk vinden we dat adenovirale infectie van ondersteunende cellen niet leidt tot toxiciteit voor haarcellen of ondersteunende cellen, zoals cellen in Ad-GFP infected utricles gelijkwaardig zijn aan die in niet-geïnfecteerde utricles (figuur 3). Zo adenovirus-gemedieerde genexpressie in de ondersteuning van cellen van gekweekte utricles biedt een krachtig instrument om de rol van ondersteunende cellen als mediatoren van haar overleving van de cel, de dood en regeneratie te bestuderen.
Protocol
Discussion
Haarcellen zijn gevoelig voor de dood veroorzaakt door een veelheid van spanningen, zoals vergrijzing, lawaai trauma, en blootstelling aan ototoxische geneesmiddelen, met inbegrip van het aminoglycoside-antibiotica en het antineoplastische middel cisplatine. Bij zoogdieren haar celdood leidt tot blijvend gehoorverlies en / of balans verstoring. In vitro model systemen zijn essentiële hulpmiddelen voor studies die gericht zijn op het bepalen van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de afdeling van de intramurale onderzoek aan het National Institute on Doofheid en Andere Communicatie Wanorde. Extra ondersteuning werd verleend door het NIDCD, toont 5R01 DC007613.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| Medium 199 | Gibco/Invitrogen | 12350 |
| DMEM/F12 | Gibco/Invitrogen | 11320 |
| Fine forceps (#55) | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Forceps (#3) | Fine Science Tools | 11231-30 |
| Penicillin G | Sigma | P3032 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 |
| Nunc mini-tray | Fisher | 12-565-68 |
| Adenovirus-GFP | Vector Biolabs | 1060* |
| Cal-Ex decalcifier | Fisher | CS510-1D |
| sodium borohydride | Sigma | 452882 |
| Anti-Myosin 7a (polyclonal) | Proteus Biosciences | 25-6790 |
| Anti-Myosin 7a (monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | MYO7A 138-1 |
| Anti-Calmodulin | Sigma | C 3545 |
| Anti-Calbindin | Chemicon | AB1778 |
| Fluoromount G | Southern Biotechnology Associates | 0100-01 |
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection.
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1×1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.
References
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. , (2006).
- Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate. J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).
- Ou, H. C. Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).
- Chiu, L. L. Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).
- Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death. Hear Res. , 221-221 (2006).
- Matsui, J. I., Cotanche, D. A. Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).
- Ryals, B. M., Rubel, E. W. Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail. Science. 240, 1774-176 (1988).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240, 1772-174 (1988).
- Shang, J. Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).
- Lahne, M., Gale, J. E. Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium. J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).
- Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin. Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).
- Matsui, J. I. Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo. J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).
- Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death. J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).
- Nakagawa, T. A novel technique for inducing local inner ear damage. Hear Res. 176, 1-2 (2003).
- Forge, A., Li, L. Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia. Hear Res. 139, 1-2 (2000).
- Liu, W. Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells. Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death. Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).
- Francis, S. P. Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32). Cell Death and Disease. , (2011).
- Wang, J. Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss. Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).
- Bird, J. E. Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear. J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).
- Sato, E. Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).
