זיהוי של Aspergillosis ריאתי פולשני בחולים ממאירות Haematological באמצעות זרימת לרוחב, טכנולוגיה

1. , אוסף אחסון והכנת נוזלים שטיפה סרום ו ברונכואלוואולרית איסוף בסרום מדגימות דם לא מטופל בכך שהוא מאפשר לדם להיקרש ב 4 ° C, סרום החנות aliquots ב -20 ° C לפני השימוש. ברונכואלוואולרית נוזלים שטיפה (BAL) צריך גם להיות מאוחסן aliquots ב -20 ° C. הערה: אחסון של בסרום BAL כמו aliquots מגבילה את פוטנציאל הפירוק של האנטיגן יעד חוזר ונשנה על ידי הקפאה, הפשרה של דגימות במהלך בדיקה חוזרת. ההפשרה דוגמאות ומערבבים את דגימות סרום ו BAL באופן יסודי על ידי vortexing ו צנטריפוגות דקות 1 14,000 סל"ד. לבדיקה שגרתית של דגימות נסיוב אדם, לדלל 01:01 בסרום (V / V) עם בינוני רקמת התרבות (TCM). TCM מורכב בינוני RPMI 1640, 10% (V / V) נסיוב עגל עוברית, 1% (V / V) של פתרון ה-L-גלוטמין 200 מ"מ, ו אזיד הנתרן (0.02% w / v) כחומר משמר. בינוני מוכנה מראש ניתן לאחסן 4 ° C למשך מספר חודשים. החל 100 μl של dilutאד בסרום כדי LFD. עבור נוזלים של באל אדם, ועל נוזלים של באל מן במודלים של בעלי חיים, חלה 100 μl של מדגם מסודר כדי LFD, עם טיפול מקדים לא. עבור סרום מ במודלים של בעלי חיים, לדלל סרום 01:02 (V / V) עם פוספט שנאגרו מלוחים המכיל 4% (w / v) EDTA, חום עבור 3min באמבט מים רותחים, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב -14,000 סל"ד, ולהחיל 100 μl של supernatant מסודר למכשיר LFD. 2. היישום של סרום ו BAL להתקן זרימת לרוחב, אחסן את הזרימה לרוחב התקנים בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס). בטמפרטורה זו, מכשירים יציבים במשך 12 חודשים. הסר את ההתקנים שלהם מתוך שקיות ומניחים על משטח ישר. משתמש קצה פיפטה סטרילית, להחיל 100 μl של מדגם טרום שטופלו BAL סרום או מסודר לנמל שחרורו של המכשיר. אפשר assay לרוץ במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, אז את התוצאות של הבדיקות צריכות להיות רשומות. הערה: בתוך שניות הנוזל יהיה SEen להעביר פעולה על ידי נימי יחד קרום nitrocellulose בחלון התצפית. 3. הקלטה פירוש תוצאות LFD LFD מורכב קו הבקרה הפנימית (מסומנת C מכתב על דיור פלסטיק) וקו הבדיקה (מסומנת האות T). קו השליטה תמיד צריך להופיע בלי קשר אנטיגן Aspergillus במדגם סרום או BAL. זה מראה כי assay יש לפעול כראוי. אם אנטיגן Aspergillus קיים במדגם סרום או BAL, פס הבדיקה יופיעו גם בתוך 15 דקות של היישום לדוגמה. בגלל האינטנסיביות של פס הבדיקה היא יחסית לכמות הנוכחית אנטיגן Aspergillus במדגם, פס הבדיקה יכול להופיע חיובי חלש (+), מתונה חיובית (+ +) או חזקה חיובית (+ + +) . עם זאת, כל פס הבדיקה חיובית, ללא קשר בעוצמה, היה להעיד על נוכחות של אנטיגן Aspergillus במדגם. במאות הבהיעדר דואר של אנטיגן Aspergillus, לא פס הבדיקה יופיעו, והתוצאה נרשמת שלילית (-). 4. נציג תוצאות דוגמאות מייצגות של שליליות, חיוביות חלשות, תוצאות חיוביות, וחזק מתונות LFD חיוביות עם דגימות של באל ו בסרום מוצגות באיור 1. תוצאות של אנטיגן חיובי בדיקות LFD (חלשה וחזקה) או בדיקות LFD שליליות באמצעות נוזלים של באל מלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) חולים מאובחנים על פי EORTC / MSG הקריטריונים לאבחון מוצגים בטבלה 1. כלול בלוח זה הם המתאימים קליניים mycological (galactomannan ותרבות) הנתונים ותוצאות בדיקת PCR Aspergillus ספציפית שפותחה סנט ברתולומיאו החולים 8, לכל מטופל. אבחון המחלה מבוסס על גורמים המארח (נויטרופניה, שימוש ממושך בסטרואידים, טיפול אחרים T-cell immunos מוכריםuppressants), קריטריונים קליניים חיוביות עבור GM BAL (מוגדרת כאן כערך ראשי GM> 0.8). על פי EORTC 2002 / MSG ההנחיות 10, חולי 12, 13 ו -16 אובחנו עם IA "אפשר" על פי גורמים המארחות ואמות מידה קליניות חיוביות או GM. על פי המתוקן (2008) EORTC / MSG הנחיות 2, גורמי המארחות חיוביות GM בלבד או מארחים גורמים וקריטריונים קליניים בלבד לא היה מציין זיהום "אפשרי" פטרייתי פולשני, אלא אם כן מלווה ראיות תומכות מנתונים קליניים תורת הפטריות בהתאמה. החולה אובחן עם 6 IA "סביר" על פי שני קווים מנחים 2002 ו 2008, בשל גורמים המארחות, מאפיינים קליניים ראשיות ומשניות חיוביות ו GM. שים לב, כי בעוד לא LFD ולא מבחני ה-PCR כלולים כיום הנחיות EORTC / MSG, יש הסכמה חזקה בין שני מבחני הבדיקה מסחרי galactomannan המעידים על נוכחות של אנטיגן אספרגילוס ו חומצות גרעין במדגם BAL ים של חולים 6 ו 12. תוצאות נוספות של מחקרים המדגימים את היעילות של מבחני LFD ו PCR באבחון IPA ניתן למצוא ג'ונסון ואח' 8. באיור 1. שלילי (פס בקרה בלבד) וחיובי (מלאה פס הבדיקה) תוצאות הבדיקות LFD שימוש בסרום BAL. את עוצמות של התגובות פס הבדיקה הם יחסי הריכוזים של אנטיגן המטרה של דגימות סרום ו BAL. התגובות בדרך כלל נע בין חלש (+) דרך מתונה (+ +) כדי חזק (+ + +). ללא תלות בעוצמת פס הבדיקה, את כל שלושת תגובות חיוביות בסרום היה מציין aspergillosis פולשני מחלת ריאות בשל נוכחותם של מחזורי אנטיגן Aspergillus בדם. התגובות החיוביות של באל (חלש, בינוני או חזק) היה מציין נביטה של ​​נבגי העובש ופיתוח פוטנציאל פתוגני בריאות. pdflinebreak "> החולה לא. Patiאף אוזן גרון מידע קריטריונים קליניים 1 BAL תרבות 2 GM EIA עמוד 3 EORTC / MSG (2002) 4 EORTC / MSG (2008) 5 Aspergillus התוצאה PCR LFD התוצאה 6 – סרן ה-CT סימנים (גולה ו הילה) ואחד קטין שלילי 0.9 (חיובי) סביר סביר חיובי חלש חיובית (+) 12 חזקה זיהום פטרייתי הקודם לא גדול, קטן 1 קנדידה glabrata 6.43 (חיובי חזק) אפשרי אף אחד חיובי חזקה חיובית (+ + +) 13 Coagulase שלילי Staphylococcus וא ' החיידק בדם לא גדול, 2 קטין שלילי 0.25 (שלילי) אפשרי אף אחד שלילי שלילי (-) 16 זיהום בחזה 3 קריטריונים קלים כולל השתפכות חדשה בלשון רבים לחדור פלוס שלילי 0.16 (שלילי) אפשרי אף אחד שלילי שלילי (-) 1 גושים או בהילות על טומוגרפיה ממוחשבת סריקה הוא מרמז על זיהום פטרייתי 2 קנדידה glabrata בנוזל BAL יחשב המזהם כפי שהוא שמרים השני בשכיחותו מבודדת כחלק פלורה אדם נורמליים 9 3 מדד> 0.8 במבחן GM EIA בל מעיד על אספרגילוס הזיהום 4 בהתבסס על EORTC 2002 / MSG הקריטריונים לאבחון "possible "," סביר "או" מוכח "מחלה פטרייתית פולשנית 10 5 על פי המתוקן (2008) EORTC / MSG הקריטריונים לאבחון "אפשר", "סבירות" או "מוכח" מחלה פטרייתית פולשנית 2 טבלה 1. תוצאות של בדיקות של דגימות של באל LFD של חולי לוקמיה מיאלואידית חריפה עם IPA סביר ומתוך חולי שליטה AML (אין עדות לזיהום), וכן EORTC / MSG אבחנה של זיהום.