ラテラルフロー技術を用いた血液学的悪性腫瘍患者における侵襲性肺アスペルギルス症の検出

1。収集、保管および血清および気管支肺胞洗浄液の調製 4℃で凝固するために使用する℃、-20℃でアリコートとして店舗血清°Cの前に血液を可能にすることにより、未処理の血液サンプルから血清を収集。気管支肺胞洗浄液（BAL）も、-20℃でアリコートとして格納する必要があります注：分注し、血清及びBALの記憶域が繰り返し繰り返しテスト中にサンプルの凍結融解することによって、標的抗原の分解の可能性を制限します。 雪解けサンプルと14,000 rpmで1分間ボルテックスし、遠心分離によって徹底的に血清およびBAL試料を混ぜ合わせる。 ヒト血清サンプルのルーチンテストのために、組織培養培地（TCM）と血清1:1（v / v）を希釈します。 TCMは、RPMI-1640培地、10％（v / v）のウシ胎児血清、200mMのL-グルタミン溶液の1％（v / v）の、そして防腐剤としてアジ化ナトリウム（0.02％w / v）で構成されています。培地は事前に準備されており、数ヶ月間、4℃で保存することができます。 dilutの100μlを適用するLFDにED血清。 人間BAL流体、および動物モデルからBAL流体には、無治療前に、LFDにきちんとしたサンプル100μlを適用します。 動物モデルからの血清のために、リン酸塩は沸騰水浴、14,000 rpmで5分間遠心し、適用される100で4％（w / v）のEDTA、3分の熱を含む緩衝生理食塩水で血清1:2（v / v）を希釈するLFDデバイスへのきちんとした上清の添加。 2。ラテラルフローデバイスへの血清およびBALのアプリケーション室温（23℃）で横方向のフローデバイスを格納します。この温度で​​は、これらのデバイスは12ヶ月間安定しています。レベルの表面にその袋と場所からデバイスを削除します。 滅菌したピペットチップを使用して、デバイスのリリースポートに前処理した血清またはきちんとしたBAL試料100μlを適用します。 アッセイは、テストの結果が記録されるべき時に室温で15分間、実行することができます。注：秒以内に流体がSEになるenは、観測窓のニトロセルロース膜に沿って毛管作用によって移行することができます。 3。 LFD結果を記録するとの解釈 LFDは、内部制御ライン（プラスチックハウジング上に文字Cで示される）とテストライン（文字Tで示される）で構成されています。コントロールラインは常に血清またはBAL試料中にアスペルギルス抗原にかかわらず表示されます。これは、アッセイが正しく実行されたことを示しています。 アスペルギルス抗原は、血清またはBAL試料中に存在する場合は、テストラインは、サンプル·アプリケーションの15分内に表示されます。試験線の強度は、試料中のアスペルギルス抗原の存在量に比例するので、テストラインが（+）弱い陽性として表示されることが、中等度陽性（+ +）または強い正（+ + +） 。しかし、任意の正のテストラインは関係なく、強度、試料中のアスペルギルス抗原の存在を示すことになる。番目のアスペルギルス抗原の電子の不在は、全くテストラインが表示されません、結果は負の値として記録されます（ – ）。 4。代表的な結果 BALと血清サンプルと負の、弱い陽性、中等度陽性、強陽性のLFD結果の代表例を図1に示されています。 抗原陽性LFDテスト（弱いものと強いもの）や急性骨髄性白血病（AML）患者からBAL流体を用いた負LFDテストの結果を表1に示されているEORTC / MSG診断基準に従って診断した。このテーブルに含まれる、対応する臨床的および菌（ラクトマンナンと文化）データであり、 アスペルギルス特異的PCR検査の結果は、各患者のために、セントBartholomews病院8で開発しました。病気の診断は、宿主因子（好中球減少症、コルチコステロイドの長期使用、他の認識T細胞immunos治療に基づいていたuppressants）、臨床的基準とBALのためにGM陽性（ここではGMのインデックス値> 0.8として定義されます）。 2002 EORTC / MSGのガイドライン10の下に、患者12、13および16は、宿主因子と臨床的基準またはGM陽性に基づいて'可能' IAと診断された。それぞれの臨床データおよび真菌学からの証拠をサポートすることで、同行しない限り、改訂された（2008年）EORTC / MSGのガイドライン2、宿主因子とGM陽性単独で、あるいは宿主因子単独で臨床的基準によれば、 "可能性"侵襲性真菌感染症を示しませんでした。患者6はために宿主因子、メジャーとマイナーの臨床的特徴とGM陽性の両方の2002年から2008年のガイドラインの下にある "可能性" IAと診断されました。 LFDやPCRアッセイのどちらも現在はEORTC / MSGのガイドラインに含まれていながら、2アッセイおよびBAL試料におけるアスペルギルス抗原、核酸の存在を示す商業ガラクトマンナンのテストの間に強い合意があるに注意し、患者の6〜12の秒。 IPAを診断するLFDやPCRアッセイの有効性を実証する臨床試験の追加の結果は、Johnson ら 8に記載されています。 図1血清およびBALを使用してLFDテスト（コントロール及びテストライン）負（コントロールラインのみ）と肯定的な結果。テストライン反応の強度は、血清およびBALサンプル中の標的抗原の濃度に比例します。反応は一般的に範囲から弱（+）中等度から（+ +）への強い（+ + +）。かかわらず、試験線の強度の、すべての3つの血清陽性反応が血流中にアスペルギルス抗原を循環の存在に起因する侵襲性肺アスペルギルス症を示すことになる。正のBAL反応（弱、中程度または強い）は、胞子や肺の潜在的に病原性の菌糸の開発の発芽を示すであろう。 pdflinebreak "> 患者ません。 PatiENT情報 臨床基準1 BAL文化2 GM EIAインデックス3 EORTC / MSG（2002）4 EORTC / MSG（2008年）5 アスペルギルス PCRの結果 LFD結果 6 – 主要なCT記号（結節とハロ）とマイナー1 負 0.9（正） 考えられる考えられる正のプラス（+）弱い 12 推定される以前の真菌感染症主要ないいえ、マイナー1 カンジダglabrata 6.43（正強） 可能なし正の強い陽性（+ + +） 13 コアグラーゼ陰性ブドウ球菌ylococcusとE.血液中の大腸菌 大きな、二つのマイナーません負 0.25（負） 可能なし負マイナス（ – ） 16 肺感染症潜入し新たに加え、複数の胸水を含む3つのマイナーの基準負 0.16（負） 可能なし負マイナス（ – ） CTスキャンで1結節またはハローは、真菌感染症を示唆するそれはヒトの正常細菌叢の一部として単離された9番目の最も一般的な酵母であるとして、BAL液中の2 カンジダglabrataは、汚染物質と見なされる BALのGM EIA試験で> 0.8の3指数は、 アスペルギルス感染症の指標である 4 'possibl 2002 EORTC / MSG診断基準に基づいて、E '、'可能性'や'実績のある侵襲性真菌症10 5 '可能性'の改訂（2008）EORTC / MSG診断基準、 '可能性'や'実績'侵襲性真菌症2に基づく 表1。可能性IPAを伴う急性骨髄性白血病の患者から、制御AML患者（感染の証拠なし）、および感染のEORTC / MSG診断からBAL試料のLFD試験の結果。