Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo

1. Topo crioconservazione degli spermatozoi Per ogni linea da crioconservati, i seguenti elementi prima di iniziare. 1 vasca di un 4-ben piatto con 240 l di kit CPA 15 cannucce crioconservazione degli spermatozoi come segue Collegare il 0,25 ml cannucce al siringhe da 1 ml con il tappo di cotone più vicino alla siringa. In ogni paglia, carico di 8 cm (circa 160 microlitri) di media FIV, quindi 1 cm di aria. Etichettare il cannucce con il nome della linea da conservare. LN 2 dovrebbe essere di 15 cm di profondità nella casella di schiuma. Chiudere il coperchio. Euthanize 2 topi maschi da ogni riga di essere crioconservati. I topi dovrebbero essere tra 10 e 60 settimane di età. Rimuovere le due epididimi caudale insieme al dotto deferente di ogni topo. Posizionare il epididimi nel precedentemente preparato CPA contenenti anche di un 4-ben piatto (passo 1.1). Fare 5-7 tagli longitudinali in ogni epididimo e delicatamentespremere ogni dotto deferente per spingere lo sperma fuori. Agitare la miscela e CPA epididimo a mano delicatamente a temperatura ambiente per 3-5 minuti. Questo permetterà spermatozoi a nuotare fuori. Utilizzando la paglia precedentemente preparato, aspirare 5 mm (circa 10 microlitri) di sospensione di spermatozoi e quindi 1 cm di aria. Ripetere questa operazione fino a un totale di 15 cannucce. Carico e di tenuta cannucce entro 10 minuti per la sopravvivenza degli spermatozoi migliori. Si chiude entrambi i lati della paglia con attenzione. Posizionare il cannucce nel contenitore con la colonna congelamento dello sperma prima. Fissare il 1 pipetta ml fornito come parte del kit per il canestro di estendere la maniglia. Posizionare il contenitore in LN 2 nella casella schiuma attraverso il foro nel coperchio. Lasciare che il canestro di galleggiare verticalmente nel LN 2 per 10 minuti. Immergere il contenitore nel LN2. Lo sperma è ora crioconservati e può essere spostato lungo termine LN 2 di stoccaggio. Il contenitore non deve essere utilizzato perla riga successiva fino a quando è riscaldato a temperatura ambiente. 2. Topo superovulazione In generale, l'uso di giovani topi di sesso femminile lo stesso sfondo i donatori di sperma. I topi devono essere ~ 12 g (3-4 settimane di età). Eseguire un'iniezione intraperitoneale con 5-10 UI di gravidanza siero di cavalla gonadotropina (PMSG). Attendere 46-48 ore. Eseguire un'iniezione intraperitoneale con 5-10 UI di gonadotropina corionica umana (hCG). Ovociti vendemmia 14-16 ore dopo l'iniezione di hCG come descritto di seguito. 3. Topo di recupero degli spermatozoi e fecondazione in vitro Prima di fecondazione in vitro, per ogni paglia di essere scongelati, i seguenti elementi ed equilibrare per almeno un'ora a 37 ° C CO 2 incubatore. Spermatozoi piatto di incubazione: un piatto 35 millimetri Petri, con un calo 90 l di media sperma trattamento (STM) ricoperto di olio. Taglio piatto: Per la raccolta degli ovociti da un massimo di 10 superovulated femmine, una 35 millimetri Petri piatto con 3 ml di terreno fecondazione in vitro. FIV bene: per ogni gruppo di 5 femmine superovulated per la FIV, un pozzetto di un piatto ben 4 con 500 l di media FIV (se si utilizza superovulated 10 femmine, per esempio, avrete bisogno di 2 pozzi…) Lavaggio delle stoviglie: una piatto 35 millimetri Petri con 3 ml di simplex di potassio medio ottimizzato (KSOM) per lavare ogni pozzetto del 4-ben piatto FIV utilizzate Cultura piatto: un piatto di 35 millimetri di Petri con 50 gocce l di media KSOM ricoperto di olio per coltura degli embrioni da ogni pozzetto del piatto FIV. Rimuovere una cannuccia da LN 2 e mettere in un bagno d'acqua a 37 ° C per 2-3 minuti. Rimuovere la paglia dal bagnomaria e pulire per rimuovere l'acqua in eccesso. Effettuare il primo taglio vicino alla colonna d'aria al più vicino la spina cotone. Tagliare la paglia nel medio FIV ci saranno ancora una colonna d'aria visibile prima della colonna sperma. Poi tagliare la fine della paglia nel seconda colonna d'aria, facendo attenzione a evitare di tagliare la colonna sperma. Tagliata in un angolo di 45 – questo renderà molto più facile per aspirare lo sperma. Aspirare la sospensione dello sperma a partire dalla fine distale della paglia con una pipetta 200 l. Posizionare la sospensione spermatozoi nel centro della goccia STM e incubare il piatto per 45-60 minuti a 37 ° C 5% CO 2 incubatore. Durante l'incubazione degli spermatozoi, sezionare gli ovidotti delle femmine superovulated nel piatto di taglio. Utilizzare un ago 30 g o pinze per strappare ogni ovidotto, rilasciando il cumulo-ovocita complessi (COC). Evitare grassi e sangue nel medio FIV come sporco dei media rende fasi di lavaggio in più. Una volta che tutti gli ovidotti sono stati strappati, trasferire i contraccettivi orali combinati da 5 femmine per ogni pozzi fecondazione in vitro. Il numero di COC prodotta da superovulazione è molto sforzo dipendente. Raccogliere 10-15 ml di sperma dalla periferia della goccia STM e fertilizzare uno FIV e circa 14-16 ore dopo hCG injezione. Ripetere per ogni fecondazione ben utilizzato. Concentrazione dello sperma finale sarà di circa 1 milione / ml. Co-coltura spermatozoi e ovociti per 4-6 ore a 37 ° C 5% CO 2 incubatore. Lavare gli embrioni con KSOM un minimo di 2 volte e la cultura in gocce KSOM per lo sviluppo a 37 ° C 5% CO 2 incubatore. Tasso di fecondazione in vitro è stato calcolato come embrioni di cellule a doppio stadio di ovociti totale utilizzata dopo una notte della cultura. 4. Rappresentante Risultati Spermatozoi dal 5 Charles River ceppi di topi inbred è stato congelato. Rapporti di protezione sono calcolati dividendo gli spermatozoi congelati i valori di valutazione da valori freschi valutazione degli spermatozoi. Rapporti di protezione della motilità degli spermatozoi sono stati 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% per C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, rispettivamente. Rapporti di protezione per una rapida motilità progressiva sono stati 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% in C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas Crl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, rispettivamente (Fig. 1). I tassi di fecondazione in vitro con gli spermatozoi congelati-scongelati sono stati il ​​55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% e 26,2% nel C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, rispettivamente (Fig. 2) . Nel corso di un periodo di 1,5 anni, 49 linee di topo geneticamente modificato sono stati archiviati dalla crioconservazione degli spermatozoi. Queste linee sono stati successivamente recuperati con successo (come definito da cuccioli nati vivi) da FIV in 4 ceppi di sesso femminile (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 e 129Sv) (Fig. 3). Figura 1. I rapporti Tutela della motilità spermatica e la motilità progressiva rapida nei topi Figura 2. Fecondazione in vitro con lo sperma congelato, scongelato in topi 3713fig3.jpg "/> Figura 3. Fecondazione in vitro con spermatozoi congelati-scongelati in topi GM