La determinación óptima de la actividad citotóxica de las células T específicas Her2Neu CD8 Humanos comparando el Ensayo de liberación de Cr51 al Sistema xCELLigence

1. Generación de CD8 Lines 7 células T antígeno-específicos humano a corto plazo Separa las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de la sangre de los donantes positivos de HLA-A2 sanos normales utilizando Ficoll-Paque más. Añadir 2 ml / pocillo de PBMCs de placas de 6 pocillos a 2 x 10 6 células / ml. Añadir HER-2/neu HLA-A2 de unión a p369-377 péptido (secuencia de aminoácidos KIFGSLAFL) o HLA-A2 de unión a la gripe p58-66 péptido (GILGFVFTL) directamente a los pocillos a una concentración final de 10 mg / ml y lugar en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. Para ayudar a estimular y expandir las células T, añadir, cada 2 días, 250 medios de comunicación l / pocillo fresco suplementado con IL-2 recombinante humana (existencia: 50 unidades / l) para alcanzar una concentración final de 50 unidades / ml en el medio de cultivo. Vuelva a estimular las células de cultivo con 2 x 10 6 células / ml PBMCs autólogas irradiadas pulsadas durante 2 horas con 10 g / ml de los mismos péptidos utilizand en el paso 1.3 y añadir estas células a cultivos a 1 ml / pocillo de una semana después de la primera estimulación péptido. Agregar medios humanos recombinantes IL-2 y fresco, como se describe en el paso 1.4, en las culturas existentes cada 2 días. Vuelva a estimular las células con PBMC autólogas irradiadas y péptido como se describe en el Paso 1.5 una semana después de la segunda estimulación péptido. Prepárese para utilizar las células seis días después de la re-estimulación última a la primera. 2. Preparación de las células del cáncer de pecho Coloque la estación de medición de impedancia xCELLigence (estación xCELLigence) en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. Células tumorales humanas cosecha (SKBR3, BT20, MCF7 o HCC1419) que son 75% de confluencia usando 0,25% de tripsina y centrifugación (1000 rpm durante 5 minutos). Contar las células tumorales utilizando un hemocitómetro y reconstituir ellos en los medios de comunicación tumorales RPMI (suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 500 unidades / mlIFN-gamma) a una concentración de 7,5 x 10 3 tumoral células/100 l. Programe el software xCELLigence mediante la creación de la página de diseño para determinar el diseño bien y mediante la creación de la página de calendario para tomar lecturas de impedancia cada 5 minutos durante un período de 40 horas. Para las primeras 18 horas, el sistema xCELLigence tomará lecturas de impedancia de sólo las células tumorales. Añadir 100 l de los medios de comunicación tumorales RPMI a la xCELLigence E-placas y realizar una lectura de fondo mediante la medición de la impedancia en ausencia de células. Añadir las células tumorales a la dirección de las placas a 100 l por pocillo y colocar en la estación xCELLigence. Pulse el botón de inicio en el software xCELLigence comenzar a tomar lecturas de impedancia de las células tumorales, que inmediatamente comienzan adherirse a la dirección de las placas. 3. Co-cultivo de tumor con las células T CD8 Una vez que las células tumorales se han unido y se duplicó a 1,5 x 10 4 células tumorales por pocillo (aproximadamente 18 horas después de haber sido inicialmente plateado), las células T cosecha preparados en la Sección 1 por raspado suave y agitación Centrifugar a 1000 rpm durante 5 minutos y contar las células T usando un hemocitómetro y reconstituir en medio RPMI con 10% de SFB a varias relaciones, a partir de una relación máxima de 1 célula tumoral a 40 células T y se diluye 2 veces hasta una relación de se alcanza 1 célula tumoral a 1,25 células T. Por ejemplo, hay 1,5 10 4 células tumorales x por pocillo. Para lograr una relación de 01:40, añadir 10 5 células T 6 x por pocillo y diluir las células T 2 veces hasta una proporción de 1,5 x 10 4 células tumorales a 1,875 x 10 4 células T por pocillo (relación de 1:1,25) se logra. Detenga la estación xCELLigence y retire el E-plato. Retire el medio de los pocillos con una pipeta y añadir 200 l de medio solo o en la proporción adecuada de las células T a los pozos. Coloque el E-placa posterior en la estación xCELLigence y continuar el pro software xCELLigencegramo por lo lecturas de impedancia se toman cada 5 minutos durante aproximadamente 20 horas después de la adición de células T. Normalizar los resultados al final del ensayo. 4. Cromo lanzamiento ensayo (CRA) 7 Siga los procedimientos de seguridad radiológica institucionales cuando se trabaja con 51 Cr y 51 células diana Cr-etiquetados. Siempre use protección adecuada para reducir la exposición a la radiación. Pulso células tumorales durante 2 horas a 1 x 10 6 células tumorales / ml con 10 l / ml fresca 51 Cr (0.005 Ci / ml). Lavar las células tumorales en 10 ml de medio RPMI con 10% de FBS y se centrifuga a 1000 rpm durante 5 minutos. Añadir las células tumorales a una placa de 96 pocillos de fondo redondo de 5 a 10 células tumorales en 1 x 100 l / pocillo. Añadir las células T en diversas proporciones, a partir de 1 célula tumoral a 40 células T y se diluye 2 veces hasta una proporción de 1 célula tumoral a las células T se consigue 1,25. Por ejemplo, hay 10 5 células tumorales 1 x por pocillo. Para lograr una relación de 01:40, añadir 10 6 células T 4 x por pocillo y diluir las células T 2 veces hasta una proporción de 1 x 10 5 células tumorales a 1,25 x 10 5 células T por pocillo (relación de 1:1,25) se logra. Agregar controles de células tumorales espontáneas y máximo de la placa. Con el fin de calcular la liberación espontánea de 51Cr de las células tumorales, añaden seis pozos que contienen cada una 10 5 células tumorales 1 x en 100 l a 100 l de medio RPMI con 10% de FBS. Para calcular la máxima liberación de 51Cr de las células tumorales, añadir seis pozos que contienen cada una 10 5 células tumorales 1 x en 100 l a 100 l 0,1% de Triton X-100 en PBS, que lisa todas las células. Incubar las placas durante 5 horas a 37 ° C con 5% de CO 2. Después de la incubación, retirar 50 l del sobrenadante de cada pocillo y agregarlo a una placa de Luma. Secar las placas durante toda la noche y medir CPM utilizando un contador gamma. le "Lisis Cálculo> 5. Porcentaje Ensayo de Impedancia: Tomar la lectura de impedancia, reportado como el índice de células (IC), en varios puntos de tiempo y utilizar la siguiente fórmula para determinar el porcentaje de lisis: (IC del tumor sólo – (CI tumorales + células T)) / (sólo tumor IC) * 100. CRA: Utilice la siguiente fórmula para determinar el porcentaje de lisis: (CPM experimental – CPM espontánea) / (CPM máxima – CPM espontáneo) * 100. 6. Los resultados representativos T células solas no aumentan la impedancia Células T, en general, no se adhieren a las superficies más sólidos y no requieren la adhesión para la activación y la proliferación. Por lo tanto, se planteó la hipótesis que las células T no deben contribuir a la impedancia en el xCELLigence E-placas. Para probar esto, los pocillos se carga con las células de cáncer de mama SKBR3 o células T recién purificadas humanos CD8. Impedancia se midió en el transcurso de 40 horas y un ejemplo demonst representantePuntuación esencialmente poco efecto de las células T se muestra en la Figura 1A. Por el contrario, se podría argumentar que las células T pueden disminuir la impedancia de fondo, aunque sólo ligeramente. A pesar de que, de co-cultivo reveló que el proceso de añadir las células T a las 18 horas después del inicio de las mediciones de impedancia resultó en una interrupción de impedancia (Figura 1B). Otros estudios revelaron que las interrupciones se deben en parte a la manipulación ya que la disminución en la señal podría reducirse al asegurar que la temperatura de la solución que contiene células T fue el mismo que el interior de la incubadora. Las reducciones en la impedancia mediada por las células T dependen de la dosis. La utilidad de un ensayo basado en impedancia para comparar muestras para la actividad de células T citotóxicas requiere la capacidad de distinguir entre las diferentes concentraciones de células T específicas de antígeno. Para probar si esto es posible, las células SKBR3 fueron co-cultivadas con diferentes concentracionesciones de las células T derivadas de una HER-2/neu p369-específica de células T línea. Como se muestra en la Figura 2A, la reducción en la impedancia fueron dependientes de la dosis de las células T. Figura 2B muestra que los índices de células en 10 horas siguen una simple polinomio de segundo orden en el rango de las células T. Por lo tanto, la estación de xCELLigence supervisa T CD8 mediada por la muerte celular SKBR3 de tumores en tiempo real como una caída en el índice de la célula. El ensayo basado en impedancia detecta las células T específicas de antígeno Para determinar si la reducción en la impedancia de SKBR3, que es una línea celular de HER-2/neu y HLA-A2 positivo de mama cáncer de tumor, por HER-2/neu p369 células T específicas de antígeno eran también, se incubaron pocillos separados específicos que contienen SKBR3 con las células T derivadas de la influenza (gripe) específica línea de células T. Las células-T específica GRIPE sirvieron como control no específico, siendo HLA-A2 positivo, pero no tiene ninguna capacidad de reconocer HER-2/neu. Como se muestra en la Figura 3, hay una diferencia significativa entre la actividad lítica de las células T de HER-2/neu p369-específicos en comparación con las células T GRIPE-específicos (p <0,0001). En algunos casos, las células T no específicas para el tumor (por ejemplo, GRIPE-específico o anti-CD3/anti-CD28 estimulado) demostraron un bajo nivel de actividad lítica (Figuras 3A-B). Las células T pueden matar en una de dos maneras, ya sea de forma no específica a través de Fas: interacciones ligando Fas o antígeno específicamente a través de la liberación de perforinas y granzimas. Para corroborar la idea de que las células T HER-2/neu-specific estaban matando de una manera específica de antígeno, incorporamos un anticuerpo bloqueante de Fas ligando. Como se muestra en la Figura 3B, el anticuerpo no redujo la actividad lítica de las células T de HER-2/neu p369-específicos. El anticuerpo podría inhibir la interacción entre Fas y Fas ligando, como se demuestra con las células T que son activadas de forma no específica con anti-CD3/CD28 cuentas. Estos resultados sugieren que cuandocélulas T específicas de tumor se prueban con células T no específicas de tumor, puede ser necesaria bloqueo ligando Fas a reducir la falta de interacciones mediadas por el TCR a un mínimo. Alternativamente, cuando el uso de líneas de células T cultivadas a corto plazo en el que sólo una fracción de las células T son específicas para el antígeno utilizado para la generación ex vivo, la posibilidad de activación de células T mediada por MHC de falta de coincidencia podría ocurrir que conduce a la lisis no específica. En este caso, la adición de anticuerpos que bloquean los antígenos de leucocitos humanos irrelevantes puede estar justificada. Para determinar si las células T específicas de p369 estaban matando las células tumorales en un HLA clase I de forma dependiente, ya sea anticuerpo anti-HLA de clase I o anticuerpo de control de isotipo se añadieron a los co-cultivos. Como se muestra en la Figura 3C, la lisis por las células T específicas de p369 se suprimió mediante la inclusión de anticuerpo que demuestra HLA de clase I restricción. Por último, puesto que el desarrollo de este ensayo se realiza en gran medida el uso de SKBR3, era importante determinar si otro adherente HLA-Las células tumorales que expresan A2 y HER-2/neu podrían ser matados por las células T específicas de p369. Por lo tanto, se prepararon las células T y se añadieron a una relación de 1:5 a la células tumorales HER-2/neu-expressing células HCC1419 HLA-A2 y, SKBR3, MCF-7, y. La línea de células tumorales negativas de HLA-A2, BT20 se utilizó como control negativo. Como se muestra en la figura 3D, todas estas células tumorales adicionales, salvo BT20 fueron también mató según la evaluación de la impedancia. Por lo tanto, el método parece ser útil para múltiples células tumorales adherentes de destino. El ensayo basado en impedancia es más sensible que el ensayo de liberación de cromo estándar en la detección de la actividad de células T citotóxicas El (51 Cr) ensayo de liberación de cromo (CRA), que mide la actividad citolítica ha sido durante mucho tiempo el estándar por el cual para vigilar células T CD8 respuestas. En este ensayo, las células diana (por ejemplo, células tumorales) se marcaron con 51Cr. En la mayoría de los casos, las células diana saludables pueden retener la mayoría de laradiomarcar en el transcurso del ensayo. Células T CD8 se añaden a las células diana, por lo general en concentraciones variables, y la muerte de las células diana se detecta mediante la liberación de 51Cr en el medio. Aparte del hecho de que utiliza radiación peligrosa, dos problemas principales con la CRA son una falta de sensibilidad y que el ensayo típicamente requiere grandes cantidades de células T CD8, lo que limita su utilidad. Para determinar si el ensayo basado en impedancia fue más sensible que las células T específicas de p369-CRA, HER-2/neu se generaron in vitro y aplicada, en cantidades variables, ya sea a E-placas que contienen las células tumorales sin etiquetas o placas de polipropileno estándar que contienen 51 Cr-etiquetados células diana. Las mediciones de impedancia, ya sea cromo o libre, se midieron a las 5 horas después de la adición de células T. Figura 4, un ejemplo representativo, se muestra el ensayo de impedancia supera a la de liberación de cromo. La variación intra-ensayodel ensayo de impedancia basada es típicamente por debajo de 20%. Variación intra-ensayo fue examinada, ya que el uso más amplio de este ensayo se determinará en gran medida por su forma reproducible y la variación (Figura 5). Dos líneas de células T específicas de p369 se generaron independientemente 30 días aparte y se añadieron por triplicado en un rango de células tumorales a proporciones de células T. La gráfica de inserción en la Figura 5 muestra que las líneas eran equivalentes en términos de lisis de las células SKBR3. El coeficiente de variación% se calcula en cada relación de células y se representó gráficamente. Como se muestra en la Figura 5, entre 1:40 y 1:05 ratios de los coeficientes de% de variación (CV) estaban por debajo de 15%. En la 1:2,5 y 1:1,25, sin embargo, los CV fueron altas o impredecible. Debido a la amplia variación biológica, no es posible medir la variabilidad inter-ensayo con líneas de células T primarias. <br /> Figura 1. Impedancia necesita ser normalizado después de la adición de las células T. Panel A: demuestra que las células tumorales (línea roja) y no a las células T (línea azul) son responsables de la impedancia. Se muestran los trazados de impedancia de más de 40 horas para que solo sea tumorales o células T. Se obtuvieron resultados similares a partir de un segundo experimento. Tenga en cuenta que la perturbación de la señal en aproximadamente 20 horas representa el punto de adición de las células T a los pocillos que contienen células no tumorales Panel B:. Muestra que las mediciones de impedancia se transitoriamente interrumpieron con la adición de las células T a las células tumorales. Esto requiere la normalización en algún punto de tiempo después de la adición de las células T (Véase el punto de normalización marcada en el gráfico). Las huellas se componen de puntos de datos duplicados. La huella de sólo las células tumorales se muestra en rojo. Las otras huellas representan células tumorales co-cultivadas con células T HER-2/neu p369-específicos (azul: proporción de 1,25 células T / células del tumor, el verde:proporción de 40 células T / células tumorales). Cada traza se calcula a partir de los puntos de datos duplicados recogidos cada 5 minutos a través de la duración de la cultura. Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes. Haz clic aquí para ver más grande la figura . Figura 2. Reducción de la impedancia mediada por las células T es dependiente de la dosis. Panel A: Se muestran los rastros de impedancia de SKBR3 células tumorales incubadas solo o con concentraciones variables de células T específicas de tumor. Cada traza se calcula a partir de los puntos de datos recogidos por triplicado cada 5 minutos a través de la duración de la cultura. Los resultados son representativos de 3 experimentos separados Panel B:. Se muestran los índices de células a las 10 horas a través de todos los teléfonos / tumor concentraciones de células T. La línea discontinua representa el índice de células para las células tumorales aluno. Cada símbolo es la media (± SEM) de determinaciones por triplicado. Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes. Haz clic aquí para ver más grande la figura . Figura 3. El ensayo basado en la impedancia detecta las respuestas específicas de antígeno de células T citotóxicas. El panel A muestra el nivel de lisis de las células SKBR3 por HER-2/neu las células T específicas de p369 (rojo) o células específicas GRIPE-T (azul) a los 5, 10, y 15 horas después de la co-cultivo. Cada punto de datos es la media (± SEM) de mediciones por triplicado. Los resultados son representativos de 3 experimentos separados. El panel B muestra la lisis de las células SKBR3 por las células T específicas de p369 o células T activadas de forma no específica, lo que demuestra que la lisis específica de antígeno no es debido a las interacciones de ligando Fas-Fas. Las barras negras representan co-cultivos quecontenía un anticuerpo ligando Fas. Cada barra es la lisis media (± SEM) por triplicado a las 5 horas después de la adición de las células T. Los resultados son representativos de 3 experimentos separados. El panel C muestra la lisis 10 horas después de la adición de células T de SKBR3 por las células T específicas de p369-es-HLA de clase I dependiente. Cualquiera de HLA de clase I el bloqueo o control de isotipo se añadió durante la co-cultura. Cada barra es la lisis media (± SEM) por triplicado. Este experimento se repitió dos veces con resultados similares. El panel D muestra el% de lisis de 10 horas después de la adición de células T de varios HLA-A2 +, HER-2/neu-expressing líneas de células tumorales por las células T específicas de p369. BT20, una línea celular de cáncer de mama HLA-A2-negativo se utilizó como control negativo. Cada punto representa un experimento único calculado a partir de determinaciones por triplicado. Haz clic aquí para ver más grande la figura . <img src = "/ files/ftp_upload/3683/3683fig4.jpg" alt = "Figura 4" /> La Figura 4. El ensayo basado en la impedancia es más sensible que el ensayo de liberación de cromo para la detección de tumores de células T específicas de antígeno. Se muestran los% de lisis de células SKBR3 en respuesta a concentraciones variables de células T específicas de p369 según se mide a las 5 horas después de tumor y de células T mezclar usando tanto el ensayo basado en impedancia y el ensayo de liberación de cromo. Cada símbolo es la media (± SEM) de las tres repeticiones. Los resultados son representativos de 3 experimentos separados. Figura 5. % Coeficientes intra-ensayo de variación del ensayo de citotoxicidad de células T basado en impedancia. Se muestran los coeficientes de medios% (± SD) intra-ensayo de variación en la lisis de SKBR3 más de un intervalo de concentraciones de células T específicas de antígeno. Cada símbolo es la media de tres repeticiones. Los números mostrados en la gráfica son tque significa% CV. Panel recuadro muestra la media (± sem, n = 3)% de lisis de SKBR3, a diferentes concentraciones de células T p369-377-específicos. Se muestran dos líneas de células T específicas de p369 generados de forma independiente usando células T a partir de dos donantes separados.