Détermination de l'activité cytotoxique CD8 spécifiques optimale des cellules T humaines Her2neu en comparant les Cr51 Essai de libération dans le système de xCELLigence

1. Génération de CD8 lignées de cellules T spécifiques de l'antigène humain à court terme 7 Séparer les cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP) provenant du sang de donneurs HLA-A2 positifs sains à l'aide de Ficoll-Paque Plus. Ajouter 2 ml / puits de CMSP à des plaques 6 puits à 2 x 10 6 cellules / ml. Ajouter HER-2/neu HLA-A2 contraignant p369-377 peptide (KIFGSLAFL de séquence d'acides aminés) ou la grippe p58-66 peptide (GILGFVFTL) directement dans les puits à une concentration finale de 10 pg / ml et le lieu HLA-A2 contraignant dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. Pour aider à stimuler et d'accroître les lymphocytes T, ajouter tous les 2 jours, 250 médias / puits fraîches complétées avec IL-2 recombinante humaine (Stock: 50 unités / pi) pour obtenir une concentration finale de 50 unités / ml dans le milieu de culture. Re-stimuler les cellules en culture avec 2 x 10 6 cellules / ml PBMC autologues irradiées pulsées pendant 2 heures avec 10 ng / ml des mêmes peptides utilisentd à l'étape 1.3 et ajouter à ces cellules de cultures à 1 ml / puits d'une semaine après la première stimulation du peptide. Ajouter IL-2 et fraîche médias humaines recombinantes, comme décrit dans l'étape 1.4, dans les cultures existantes tous les 2 jours. Re-stimuler les cellules avec des PBMC autologues peptidiques et irradié comme décrit dans l'étape 1.5, une semaine après la deuxième stimulation de peptide. Préparez-vous à utiliser des cellules six jours après la re-stimulation dernier au plus tôt. 2. Préparation des cellules du cancer du sein Placez la station de mesure de l'impédance de xCELLigence (station de xCELLigence) dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. Récolte des cellules tumorales humaines (SKBR3, BT20, MCF7 ou HCC1419) qui sont 75% de confluence avec 0,25% de trypsine et centrifugation (1000 rpm pendant 5 minutes). Compter les cellules tumorales en utilisant un hématimètre et les reconstituer dans les médias tumorales RPMI (complété avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 500 unités / mlL'IFN-gamma) à une concentration de 7,5 x 10 3 tumeur cellules/100 pl. Programmer le logiciel xCELLigence en mettant en place la page de présentation pour déterminer disposition bien et en mettant en place la page de calendrier pour prendre des lectures d'impédance toutes les 5 minutes pendant une période de 40 heures. Pour les 18 premières heures, le système de xCELLigence prendra lectures d'impédance des cellules tumorales seulement. Ajouter 100 ul de milieu RPMI tumorales à la xCELLigence E-plaques et d'effectuer une lecture de base en mesurant l'impédance en l'absence de cellules. Ajouter cellules tumorales à l'e-plaques à 100 pi par puits et le placer dans la station de xCELLigence. Appuyez sur le bouton de démarrage du logiciel xCELLigence commencer à prendre des mesures d'impédance des cellules tumorales, qui commencent immédiatement adhérer à l'e-plaques. 3. Co-culture de la tumeur avec des cellules T CD8 Une fois que les cellules tumorales ont attaché et a doublé à 1,5 x 10 4 cellules tumorales par puits (approximativementron 18 heures après avoir été initialement plaqué), les cellules T de récolte préparés à la section 1 par grattage doux et agitation Centrifugeuse à 1000 tours par minute pendant 5 minutes et compter les cellules T en utilisant un hématimètre et les reconstituer en milieu RPMI avec 10% de FBS à différents rapports, à partir d'un ratio maximum de 1 cellule tumorale de 40 cellules T et diluer 2 fois jusqu'à ce qu'un rapport de 1 cellule tumorale à 1,25 lymphocytes T est atteint. Par exemple, il ya 1,5 x 10 4 cellules tumorales par puits. Pour parvenir à un rapport 01:40, ajouter 6 x 10 5 cellules T par puits et diluer les cellules T 2 fois jusqu'à un rapport de 1,5 x 10 4 cellules de tumeur à 1,875 x 10 4 cellules par puits (T rapport 1:1,25) est obtenue. Mettre en pause la station de xCELLigence et retirer le E-plaque. Retirez les médias dans les puits avec une pipette et ajouter 200 ul de milieu seul ou le ratio approprié de cellules T dans les puits. Placer le dos E-plaque dans la station d'xCELLigence et poursuivre le pro logiciel xCELLigencegramme afin lectures d'impédance sont prises toutes les 5 minutes pendant environ 20 heures après l'addition des cellules T. Normaliser les résultats à la fin de l'essai. 4. Chromium Essai de libération (ARC) 7 Suivre les procédures institutionnelles de radioprotection quand on travaille avec 51 Cr et 51 cellules cibles Cr-étiquetés. Toujours utiliser un blindage approprié pour réduire l'exposition aux rayonnements. Cellules tumorales Pulse pour 2 heures à 1 x 10 6 cellules tumorales / ml avec 10 pl / ml fraîche 51 Cr (0,005 Ci / ml). Laver les cellules tumorales dans 10 ml de milieu RPMI avec 10% de FBS et centrifuger à 1000 rpm pendant 5 minutes. Ajouter cellules tumorales à un 96 puits plaque à fond rond à 1 x 10 5 cellules tumorales dans 100 pl / puits. Ajouter cellules T à divers ratios, en commençant à une cellule tumorale à 40 cellules T et diluer 2 fois jusqu'à un rapport de 1 à 1,25 cellule tumorale des cellules T est obtenue. Par exemple, il ya 1 x 10 5 cellules tumorales par puits. Pour atteindre un ratio 01:40, ajouter 4 x 10 6 cellules T par puits et diluer les cellules T 2 fois jusqu'à un rapport de 1 x 10 5 cellules tumorales à 1,25 x 10 5 cellules T par puits (ratio 1:1,25) est obtenue. Ajouter des contrôles de cellules tumorales spontanées et maximum de la plaque. Pour calculer la libération spontanée de 51 Cr des cellules tumorales, ajoutent six puits contenant chacun de 1 x 10 5 cellules tumorales dans 100 pi à 100 pi de milieu RPMI avec 10% de FBS. Pour calculer libération maximale de 51 Cr à partir des cellules tumorales, ajouter six puits contenant chacun 1 x 10 5 cellules de tumeur dans 100 ul à 100 ul de 0,1% de Triton X-100 dans du PBS, qui lyse les cellules. Incuber les boîtes pendant 5 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2. Après incubation, éliminer 50 pi du surnageant de chaque puits et l'ajouter à une plaque Luma. Sécher les plaques pendant la nuit et mesurer CPM aide d'un compteur gamma. le «Lysis calcul> 5. Pourcentage Test Impédance: Prendre la lecture impédance, a rapporté que l'indice de la cellule (CI), à différents points dans le temps et utiliser la formule suivante afin de déterminer pour cent lyse: (CI tumeur seulement – (cellules tumorales + T CI)) / (tumeur CI seulement) * 100. ARC: Utilisez la formule suivante pour déterminer pour cent lyse: (CPM expérimental – CPM spontanée) / (CPM maximale – CPM spontanée) * 100. 6. Les résultats représentatifs Les cellules T ne suffisent pas à augmenter l'impédance Lymphocytes T, en général, ne se conforment pas à la plupart des surfaces solides et n'ont pas besoin de l'adhésion pour l'activation et la prolifération. Par conséquent, il a émis l'hypothèse que les cellules T ne devraient pas contribuer à l'impédance de la xCELLigence E-plaques. Pour tester cette hypothèse, des puits ont été chargés avec soit SKBR3 cellules de cancer du sein ou de lymphocytes T CD8 humains fraîchement purifiés. Impédance a été mesurée au cours de 40 heures et un exemple représentatif demonstNote essentiellement peu d'effet sur ​​les cellules T est illustré à la figure 1A. En revanche, on pourrait faire valoir que les cellules T peuvent diminuer l'impédance de fond, mais seulement légèrement. Malgré cela, la co-culture a révélé que le processus d'ajout de cellules T à 18 heures suivant l'initiation de mesures d'impédance a entraîné une perturbation impédance (figure 1B). D'autres études ont révélé que les perturbations étaient dues en partie à la manipulation puisque la diminution du signal pourrait être réduit en s'assurant que la température de la solution contenant des cellules T a été la même que l'intérieur de l'incubateur. Des réductions de médiation de l'impédance par les cellules T sont dose-dépendants. L'utilité d'un test à base d'impédance pour comparer des échantillons pour l'activité des cellules T cytotoxiques nécessite la capacité de distinguer entre différentes concentrations de lymphocytes T spécifiques de l'antigène. Pour tester si cela est possible, les cellules SKBR3 étaient co-cultivées avec différentes concentrationstions de cellules T proviennent d'une HER-2/neu p369-spécifique lignée de cellules T. Comme le montre la figure 2A, la réduction de l'impédance étaient dépendants de la dose de cellules T. Montre 2B de figure que les indices de cellules à 10 heures suivi d'un simple polynôme du second degré sur la plage de cellules T. Ainsi, la station de contrôle xCELLigence T CD8 mort à médiation cellulaire de tumeurs SKBR3 en temps réel comme une baisse de l'indice de la cellule. Le dosage à base d'impédance détecte les cellules T spécifiques de l'antigène Pour déterminer si la réduction de l'impédance de SKBR3, ce qui est une lignée cellulaire HER-2/neu et HLA-A2 positifs cancer du sein tumeur, par HER-2/neu p369 cellules T spécifiques de l'antigène, sont des puits distincts spécifiques contenant SKBR3 ont également été incubés avec des cellules T issues d'un l'influenza (grippe) spécifique à la ligne de cellules T. Les cellules T spécifique GRIPPE servi de témoin non spécifique, étant HLA-A2 positifs, mais n'ayant aucune capacité de reconnaître HER-2/neu. Comme le montre la Figure 3, il ya une différence significative entre l'activité lytique des HER-2/neu des cellules T p369-spécifiques par rapport aux cellules T FLU-spécifiques (p <0,0001). Dans certains cas, les cellules T non spécifiques de la tumeur (par exemple FLU-spécifique ou anti-CD3/anti-CD28 stimulé) ont démontré un faible niveau d'activité lytique (figures 3A-B). Les cellules T peuvent tuer dans l'une des deux façons, soit de manière non spécifique par Fas: interactions ligand Fas ou antigène particulier grâce à la libération de granzymes et perforins. Pour plus corroborer l'idée que les cellules T HER-2/neu-specific tuaient dans un mode spécifique d'un antigène, nous avons intégré un anticorps bloquant à Fas ligand. Comme le montre la figure 3B, l'anticorps n'a pas réduit l'activité lytique de la HER-2/neu des cellules T spécifiques p369. L'anticorps peut inhiber les interactions entre Fas et de ligand, comme l'a démontré avec des cellules T qui étaient non spécifiquement activées par anti-CD3/CD28 perles. Ces résultats suggèrent que lorsquelymphocytes T spécifiques de la tumeur sont testés avec des cellules T non spécifiques de la tumeur, Fas ligand blocus peut être nécessaire pour réduire la non-TCR interactions médiatisées au minimum. En variante, l'utilisation de la culture T lignées cellulaires à court terme, dans lequel seule une fraction des cellules T spécifiques de l'antigène utilisé pour la production ex vivo, la possibilité d'une activation des cellules T non-concordance à médiation par CMH pourrait se produire conduisant à la lyse non spécifique. Dans ce cas, l'addition d'anticorps qui bloquent les AcVC non pertinents peut être justifiée. Pour déterminer si les cellules T p369-spécifiques ont été tuer les cellules tumorales dans un HLA de classe I dépendante, soit l'anticorps anti-HLA de classe I ou anticorps de contrôle d'isotype ont été ajoutés à des co-cultures. Comme le montre la figure 3C, la lyse par les cellules T spécifiques de p369 a été supprimé par l'inclusion d'anticorps démontrant HLA de classe I de restriction. Enfin, depuis le développement de ce test a été largement fait en utilisant SKBR3, il était important de déterminer si d'autres adhérents HLA-Cellules tumorales exprimant A2 et HER-2/neu pouvaient être tués par des cellules T spécifiques p369. Ainsi, les cellules T ont été préparés et ajoutés selon un rapport 1:5 à la molécule HLA-A2 et les cellules tumorales HER-2/neu-expressing, SKBR3, MCF-7 et des cellules HCC1419. La lignée cellulaire tumorale négative pour le HLA-A2, BT20 a été utilisé comme contrôle négatif. Comme le montre la figure 3D, l'ensemble de ces cellules tumorales supplémentaires, sauf BT20 ont également été tués évaluée par impédance. Ainsi, la méthode semble être utile pour plusieurs cellules tumorales adhérentes cibles. Le dosage à base d'impédance est plus sensible que le test de libération du chrome standard dans la détection de l'activité des cellules T cytotoxiques L'(51 Cr) essai de libération de chrome (ARC) qui mesure l'activité cytolytique a longtemps été l'étalon-or par lequel de surveiller CD8 réponses des lymphocytes T. Dans cet essai, les cellules cibles (par exemple, les cellules tumorales) sont étiquetés avec 51 Cr. Dans la plupart des cas, les cellules cibles en bonne santé peut conserver la majorité de laradiomarquer au cours du dosage. Lymphocytes T CD8 sont ajoutés aux cellules cibles, généralement à des concentrations variables, et de tuer des cellules cibles est détectée par la libération du 51 Cr dans le milieu. Mis à part le fait qu'il utilise un rayonnement dangereux, deux problèmes majeurs avec l'ARC sont un manque de sensibilité et que le dosage nécessite généralement de grandes quantités de lymphocytes T CD8, ce qui limite son utilité. Pour déterminer si le dosage à base d'impédance est plus sensible que les cellules T spécifiques p369-ARC, HER-2/neu ont été générés in vitro et appliquée, en quantités variables, soit à E-plaques contenant des cellules tumorales non étiquetés ou des plaques de polypropylène standards contenant 51 Cr marqué les cellules cibles. Mesures, soit chrome impédance ou libres, ont été mesurées à 5 heures après l'addition des cellules T. Figure 4, un exemple représentatif, montre l'analyse d'impédance surpasse la libération de chrome. La variation intra-essaide l'essai à base d'impédance est généralement inférieure à 20%. La variation intra-essai a été examiné, depuis plus large utilisation de ce test sera largement déterminé par sa reproductibilité et variation (figure 5). Deux lignées de cellules T p369-spécifiques ont été générées de façon indépendante intervalles de 30 jours et introduits en triple sur une gamme de cellules tumorales à des taux de lymphocytes T. Le graphique encart dans la figure 5 montre que les lignes ont été largement équivalent en termes de lyse des cellules SKBR3. Le coefficient de variation de% a été calculée à chaque rapport de cellules et tracée. Comme le montre la figure 5, entre 1:40 et 1:05 ratios des coefficients d'% de variation (CV) ont été inférieurs à 15%. Au 1:2,5 et 1:1,25, cependant, les CV ont été élevés ou imprévisibles. Parce que d'une vaste variation biologique, il n'est pas possible de mesurer la variabilité inter-essai avec des lignées de cellules T primaires. <br /> Figure 1. Impédance doit être normalisée après l'addition des cellules T. Groupe A: démontre que les cellules tumorales (ligne rouge) et non des cellules T (ligne bleue) sont responsables de l'impédance. Indiqués sont les tracés d'impédance plus de 40 heures pour les cellules tumorales soit ou T seuls. Des résultats similaires ont été obtenus à partir d'une deuxième expérience. A noter que la perturbation de signal au niveau d'environ 20 heures représente le point d'addition des cellules T dans les puits ne contenant pas de cellules tumorales Panneau B:. Montre que les mesures d'impédance sont perturbés de façon transitoire avec l'addition des cellules T à des cellules tumorales. Cela nécessite une normalisation à un certain point dans le temps suite à l'ajout de cellules T (voir point de normalisation marqué dans le graphique). Les traces sont composées de points de données en double. La trace des seules cellules tumorales est indiquée en rouge. Les autres traces représentent des cellules tumorales co-cultivées avec des cellules T HER-2/neu p369-spécifiques (Bleu: rapport de 1,25 cellules T / cellules tumorales, vert:rapport de 40 cellules T / cellules tumorales). Chaque trace est calculée à partir de points de données en double recueillies toutes les 5 minutes pendant toute la durée de la culture. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences distinctes. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 2. Réduction de la médiation de l'impédance par les cellules T est dose-dépendante. Groupe A: indiqués sont les traces d'impédance de SKBR3 cellules tumorales incubées seul ou avec des concentrations de lymphocytes T spécifiques de la tumeur variable. Chaque trace est calculée à partir des points de données en triple recueillies toutes les 5 minutes pendant toute la durée de la culture. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences distinctes Groupe B:. Indiqués sont les indices de cellules à 10 heures dans toutes les concentrations cellulaires de cellules / T tumeur. La ligne en pointillés représente l'indice de la cellule pour les cellules tumorales alune. Chaque symbole correspond à la moyenne (± écart type) des déterminations en triple. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences distinctes. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 3. Le dosage à base impédance détecte réponses spécifiques de l'antigène cellules T cytotoxiques. Un panneau indique le niveau de la lyse des cellules SKBR3 par HER-2/neu des cellules T p369-spécifiques (Rouge) ou des cellules FLU-T spécifiques (bleu) à 5, 10, et 15 heures après la co-culture. Chaque point est la moyenne (± SEM) des mesures en triple. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences distinctes. Groupe B montre la lyse des SKBR3 par les cellules T p369-spécifiques ou des cellules T non spécifiquement activées, ce qui démontre que la lyse spécifique de l'antigène n'est pas due à des interactions ligand Fas-Fas. Des barres noires représentent les co-cultures quicontenait un anticorps de ligand Fas. Chaque barre est la lyse moyenne (± SEM) en trois exemplaires à 5 heures après l'ajout de cellules T. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences distinctes. Groupe C montre lyse 10 heures après plus de cellules T de SKBR3 par les cellules T spécifiques de p369 est dépendante je HLA de classe. Soit je blocage HLA de classe ou de contrôle isotype a été ajouté lors de la co-culture. Chaque barre est la lyse moyenne (± SEM) en trois exemplaires. Cette expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires. Groupe D montre% de lyse 10 heures après plus de cellules T de plusieurs +, HER-2/neu-expressing lignées cellulaires tumorales HLA-A2 par les cellules T spécifiques p369. BT20, une lignée cellulaire de cancer du sein HLA-A2-négatif a été utilisé comme contrôle négatif. Chaque point représente une expérience unique calculé à partir des déterminations en triple. Cliquez ici pour agrandir la figure . <img src alt = "/ files/ftp_upload/3683/3683fig4.jpg" > Figure 4. Le dosage à base d'impédance est plus sensible que le test de libération du chrome pour la détection de cellules T spécifiques d'un antigène de tumeur. Sont représentés% de lyse de SKBR3 en réponse à des concentrations de cellules T p369-spécifiques variant tel que mesuré à 5 heures à la suite des tumeurs et cellules T mélanger utilisant à la fois le dosage à base d'impédance et le test de libération du chrome. Chaque symbole correspond à la moyenne (± écart type) de trois répétitions. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences distinctes. Figure 5. % Coefficients intra-essai de variation de l'essai de cytotoxicité cellulaire T à base d'impédance. Montré ya% coefficients moyennes (± écart-type) intra-essai de variation de la lyse des SKBR3 sur une plage de concentrations de lymphocytes T spécifiques de l'antigène. Chaque symbole est la moyenne de trois répétitions. Chiffres présentés dans le graphique sont til signifie% CV. panneau en médaillon montre la moyenne (± SEM, n = 3)% de lyse de SKBR3, à des concentrations de lymphocytes T p369-377-spécifiques divers. Deux lignées de cellules T spécifiques de p369 générées de façon indépendante à l'aide de cellules T de deux donneurs différents sont affichés.