xCELLigenceシステムにCR51リリースアッセイを比較することによって、人間Her2neu特異的CD8 T細胞の最適な細胞傷害活性を決定する

1。短期ヒト抗原特異的CD8 T細胞株の生成7 フィコール-paque plusを使用して、健常HLA-A2陽性ドナーの血液から分離した末梢血単核球（PBMC）。 2×10 6細胞/ mlで6ウェルプレートに2ミリリットル/ウェルのPBMCのを追加します。 HLA-A2結合HER-2/neuのP369-377ペプチド（アミノ酸の配列KIFGSLAFL）または直接、10μgの/ mlの最終濃度で井戸や場所にHLA-A2結合インフルエンザP58-66ペプチド（GILGFVFTL）を追加5％CO 2、37℃のインキュベーターである。 培地に50単位/ mlの最終濃度を達成するには、次のように刺激し、拡大するT細胞を、追加して、ヒト組換えIL-2（50単位/μlの株式）を補充し、2日毎に、250μlの/ウェル新鮮な培地に役立ちます。 再刺激同じペプチド10μgの/ mlで2時間パルス2×10 6細胞/ ml照射自家末梢血単核球と培養細胞を使用ステップ1.3のdおよび1ミリリットル/ウェルの最初のペプチド刺激後1週間で培養液にこれらのセルを追加します。 2日ごとに、既存の文化に、ステップ1.4で説明したように、ヒト組換えIL-2、新鮮なメディアを追加します。 第二のペプチド刺激後1.5一週間ステップで説明したように、ペプチド、照射自家末梢血単核球細胞を再刺激する。 6日早くとも再刺激した後、最後のセルを使用する準備を行います。 2。乳がん細胞の調製 5％CO 2、37℃のインキュベーター内エクセリジェンスインピーダンス計測ステーション（エクセリジェンスステーション）を配置します。 0.25％トリプシン及び遠心（5分間1,000 rpm）で使用して75％コンフルエントであるハーベストヒト腫瘍細胞（SKBR3、BT20、MCF7またはHCC1419）。 腫瘍RPMI培地中で再構成し、血球計を使用して、それらの腫瘍細胞を計数（10％ウシ胎児血清（FBS）、500単位/ mlを補充7.5×10 3腫瘍cells/100μLの濃度のIFN-γ）。 うまくレイアウトを決定するために、レイアウトページを設定して、40時間の期間のために5分ごとにインピーダンス測定値を取るためにスケジュールページを設定してプログラムエクセリジェンスソフトウェア。最初の18時間、xCELLigenceシステムは、腫瘍細胞のインピーダンス測定値を取る。 エクセリジェンスE-プレートにRPMI腫瘍メディアを100μlを加え、細胞の非存在下でのインピーダンスを測定することにより、バックグラウンドの読み取りを行います。 エクセリジェンス駅ではよく、場所ごとに100μlのでE-プレートに腫瘍細胞を追加します。 直ちにE-プレートに付着し始める腫瘍細胞のインピーダンス測定値を取って開始するエクセリジェンスソフトウェアのスタートボタンを押してください。 3。 CD8 T細胞と腫瘍の共培養腫瘍細胞は（うまく約当たり×10 4個の腫瘍細胞を取り付け、1.5倍にしたらmately最初にメッキされた後18時間）、穏やかなスクレイピングと撹拌によって、セクション1で調製した収穫T細胞 5分間1,000 rpmで遠心分離し、40 T細胞への1腫瘍細胞の最大比で出発して、様々な比率で10％FBSを含むRPMI培地中で再構成し、血球計を使用して、それらのT細胞をカウントした割合まで2倍に希釈する1.25 T細胞への1腫瘍細胞に到達する。例えば、ウェル当たり1.5×10 4個の腫瘍細胞が存在する。 1時40分比を達成するために、ウェル当たり6×10 5 T細胞を追加し、2倍のウェルあたり1.875×10 4 T細胞（1:1.25比）で1.5×10 4個の腫瘍細胞の割合までのT細胞を希釈達成される。 エクセリジェンスステーションを一時停止し、E-プレートを取り外します。 ピペットでウェル内のメディアを取り出し、200単独のメディアの液またはウェルにT細胞の適切な比率を追加します。 エクセリジェンス駅でE-プレートバックを置き、エクセリジェンスソフトウェアプロを続けるグラムのでインピーダンス測定値がT細胞の添加後、約20時間、5分ごとに採取される。 アッセイの終了時に結果を正規化します。 4。クロムリリースアッセイ（CRA）7 51 Cr及び51のCr標識標的細胞を操作するときの機関放射線安全手順に従ってください。常に放射線被ばくを低減するために適切なシールドを使用しています。 1×10ミリリットル/μlのフレッシュの51 Cr（0.005 CI / ml）を、10 6腫瘍細胞/ mlで2時間のパルス腫瘍細胞を。 5分間1,000 rpmで、10％FBSおよび遠心分離機を含むRPMI培地10mlに腫瘍細胞を洗浄します。を100μl/ウェルで1×10 5個の腫瘍細胞で96ウェル丸底プレートに腫瘍細胞を加える。 40 T細胞への1腫瘍細胞から始まる、様々な比率でT細胞を加えて、1.25 T細胞への1腫瘍細胞の比が達成されるまで2倍に希釈する。例えば、1×10 5腫瘍細胞が存在するウェルあたり。 、1時40分比を達成ウェルあたり4×10 6 T細胞を追加し、1×ウェルあたり1.25×10 5 T細胞（1:1.25比）10〜5腫瘍細胞の割合になるまで2倍にT細胞を希釈する達成される。 プレートに自発および最大腫瘍細胞のコントロールを追加します。 10％FBSを含むRPMI媒体を100μlに100μlの各含有する1×10 5個の腫瘍細胞を6ウェルを加え、腫瘍細胞からの51 Crの自発的放出を計算するためである。全ての細胞を溶解PBSでトリトンX-100、100μlの0.1％に100μlの各含有する1×10 5腫瘍細胞6井戸を追加、腫瘍細胞からの51 Crの最大放出を計算する。 5％CO 2で37℃で5時間培養する。 インキュベーション後、各ウェルから50μlの上清を除去し、輝度プレートに追加します。 一晩プレートを乾燥し、CPMはガンマカウンターを用いて測定します。 ル "> 5。パーセント溶解計算インピーダンス測定法：様々な時点でセルインデックス（CI）として報告インピーダンス読書を、取るとパーセントの溶解を決定するには、次の式を使用します（CI腫瘍のみ – （CI腫瘍+ T細胞））/（のみCI腫瘍） * 100。 CRA：パーセントの溶解を決定するには、次の式を使用します（CPM実験 – CPM自発）/（CPM最大 – CPM自発）* 100。 6。代表的な結果 T細胞は単独のインピーダンスを増加させない T細胞は、一般的に、ほとんどの固体表面に付着せず、活性化および増殖のための遵守を必要としません。したがって、T細胞がエクセリジェンスE-プレートのインピーダンスに寄与しないことを仮定された。これを試験するために、ウェルをSKBR3乳癌細胞又は新たに精製されたヒトCD8 T細胞のいずれかを負荷した。インピーダンスは、40時間にわたって、代表例のdemonstにわたって測定したT細胞の分布本質的にはほとんど影響を図1Aに示されている。これに対して、T細胞が僅かではあるが、バックグラウンドインピーダンスを減少させることができると主張することができる。それにもかかわらず、共培養は、インピーダンスの測定の開始後18時間後にT細胞を添加するプロセスは中断インピーダンス（ 図1B）をもたらしたことが明らかになった。他の研究では、混乱が部分的に信号における減少は、T細胞を含む溶液の温度を確実にすることによって減少させることができるので、取り扱いに起因することが明らかになったインキュベータの内部と同じであった。 T細胞によるインピーダンス媒介の減少は用量依存性である。 細胞傷害性T細胞活性のためのサンプルを比較するためのインピーダンスに基づくアッセイの有用性は、抗原特異的T細胞の異なる濃度を区別する能力を必要とする。これが可能であるかどうかをテストするために、SKBR3細胞は、濃度を変化させると共培養したHER-2/neuのP369特異的T細胞株由来のT細胞のtions。 図2Aに示すように、インピーダンスの減少は、T細胞の投与量に依存していた。 図2Bに示す、10時間でのセルインデックスは、T細胞の範囲にわたって単純な二次多項式に従うこと。このように、エクセリジェンスステーションはセルインデックスの低下のようにリアルタイムでSKBR3腫瘍のCD8 T細胞媒介死を監視します。 インピーダンスに基づくアッセイは、抗原特異的T細胞を検出する HER-2/neuのとHLA-A2陽性の乳癌腫瘍細胞株であるSKBR3のインピーダンスの減少は、HER-2/neuのP369により特異的T細胞は抗原であったかどうかを判断するSKBR3を含む特定の、別々のウェルはまた、インキュベートした。インフルエンザ（FLU）特異的T細胞株由来のT細胞である。 FLU特定-T細胞は、HLA-A2陽性で、非特定のコントロールを務めたが、HER-2/neuのを認識する任意の能力を持っていない。 無線LANに示すように、グレ3は、FLU-特異的T細胞た（p <0.0001）と比較したP369-特異的T細胞の溶解活性HER-2/neuの間に有意な差がある。いくつかのケースでは、腫瘍に特異的ではないT細胞（例えば、FLU固有またはanti-CD3/anti-CD28が刺激）溶解活性（ 図3A-B）のローレベルを示した。 T細胞は、どちら非特異Fasを介して、次のいずれかの方法で殺すことができる：Fasリガンドの相互作用や抗原特異的にグランザイムとパーフォリンのリリースまで。さらにHER-2/neu-specific T細胞が抗原特異的様式で殺害されたという考えを裏付けるために、我々はFasリガンドに対する遮断抗体を組み込んだ。 図3Bに示すように、抗体は、HER-2/neuのP369特異的T細胞の溶解活性は低下しなかった。抗体は、抗CD3/CD28ビーズで非特異的に活性化したT細胞を用いて実証したFasとFasリガンド間の相互作用を阻害することができます。これらの結果は、時腫瘍特異的T細胞は、非腫瘍特異的T細胞を用いて試験され、Fasリガンドの遮断を最小限に非TCR媒介相互作用を低減するために必要とされ得る。あるいは、短期の培養T細胞株を使用する場合にT細胞の一部のみが、ex vivoでの生成に用いた抗原に対して特異的であるには、MHCミスマッチ媒介性T細胞活性化の可能性は、非特異的溶解をもたらす発生する可能性がある。この場合には、無関係なHLASを遮断する抗体の添加は保証することができる。 P369-特異的T細胞は、HLAクラスI依存的に腫瘍細胞を死滅させる、のいずれかの抗HLAクラスI抗体またはアイソタイプ対照抗体したかどうかを判断するためには、共培養物に添加した。 図3Cに示すように、P369-特異的T細胞による溶解は、HLAクラスI制限を示す抗体を含めることによって抑制された。このアッセイの開発は主としてSKBR3を使用して行われたので最後に、それは確認するためであれば、他の接着性HLA-重要だったA2とHER-2/neuの発現する腫瘍細胞がP369特異的T細胞によって殺される可能性があります。これにより、T細胞を調製し、HLA-A2とHER-2/neu-expressing腫瘍細胞、SKBR3、MCF-7、およびHCC1419細胞に1:5の比率で添加した。 HLA-A2陰性の腫瘍細胞株、BT20を陰性対照として用いた。インピーダンスにより評価されるBT20も死亡した以外は同様に、 図3Dは 、これらの追加の腫瘍細胞の全てに示す。したがって、この方法は、複数のターゲット付着腫瘍細胞に有用であると思われる。 インピーダンスに基づくアッセイは、細胞傷害性T細胞活性を検出することで標準クロム放出アッセイよりも敏感である細胞溶解活性を測定し、クロム（51 Cr）から放出アッセイ（CRA）が長いCD8 T細胞応答を監視するためにそれによってゴールドスタンダードとなっています。このアッセイでは、標的細胞（例えば、腫瘍細胞） の51 Crで標識される。ほとんどの場合、健康な標的細胞中の大部分を保持することができる検定の過程で放射性標識。 CD8 T細胞は、通常、様々な濃度で、標的細胞に添加し、標的細胞の死滅される媒体中への51 Crの放出によって検出される。それを除いては、有害な放射を使用するという事実から、CRAを持つ2つの主要な問題は、感度の欠如であり、このアッセイは、典型的にはその有用性を制限し、CD8 T細胞を大量に必要とする。インピーダンスに基づくアッセイは、ラベルの付いていない腫瘍細胞または含む標準ポリプロピレンプレートを含むE-プレートのいずれかに、様々な量では、CRA、HER-2/neuのP369-特異的T細胞をin vitroおよび応用で生成されたよりも敏感であったかどうかを判断するにはの51 Crで標識した標的細胞。測定は、インピーダンスまたはクロムのいずれかを、T細胞の添加後5時間で測定した。 図4は 、代表的な例として、インピーダンスアッセイは、クロム放出よりも優れて示している。 アッセイ内変動インピーダンスベースアッセイの下、通常の20％である。 このアッセイの普及が大きく、その再現性および変動（ 図5）によって決定されるので、アッセイ内変動を調べた。二P369特異的T細胞株は、30日間隔を独立に生成され、T細胞比に対する腫瘍細胞の範囲にわたって三連で添加した。 図5の挿入図のグラフは、線がSKBR3細胞を溶解の面で大幅に同等であったことを示しています。変動のパーセント係数は、各セル比で算出してプロットした。 1時40分〜1:5の比との間に、 図5に示すように、変形例（CV）の％係数は15％以下であった。 1:2.5と1:1.25では、しかし、CVが高いか予測不可能であった。なぜなら広範な生物学的変動するのではなく、一次T細胞株をアッセイ間変動を測定することは不可能である。 <br /> 図1。インピーダンスは、T細胞の添加後に正規化する必要がある。パネル：腫瘍細胞（赤線）としないT細胞は（青線）インピーダンスに責任があることを示しています。示すだけでは腫瘍またはT細胞のための40時間にわたってインピーダンストレーシングです。同様の結果は、第二の実験から得た。約20時間での信号摂動が腫瘍細胞を含有しないウェルにT細胞の添加の点を表すことに注意パネルBは：インピーダンス測定が一時的に腫瘍細胞に対するT細胞の添加により破壊されることを示している。これは、T細胞（グラフでマーク正規化の点参照）を添加した後、いくつかの時点において正規化を必要とする。トレースは、重複データポイントから構成されています。単独の腫瘍細胞のトレースは赤で示されています。 1.25 T細胞/腫瘍細胞の比が、グリーン：他のトレースのHER-2/neu P369特異的T細胞（青と共培養した腫瘍細胞を表す40 T細胞/腫瘍細胞）の割合。各トレースは、培養の期間を通して、5分ごとに収集された重複データ·ポイントから算出される。結果は、3つの別々の実験を代表するものである。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。 図2。 T細胞によるインピーダンス媒介の減少は投与量に依存しています。パネル：示されているが、単独で、または腫瘍特異的T細胞の様々な濃度でインキュベートしたSKBR3腫瘍細胞のインピーダンストレースです。各トレースは、培養の期間を通して、5分ごとに収集された三連のデータポイントから算出される。結果は3つの別々の実験の代表であるパネルB：細胞/腫瘍細胞濃度すべてT渡って10時間で細胞指標も示されている。破線は、腫瘍細胞らのセルインデックスを表す1。各シンボルは、3回の測定の平均値（±SEM）である。結果は、3つの別々の実験を代表するものである。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。 図3。インピーダンスに基づくアッセイは、抗原特異的細胞傷害性T細胞応答を検出する。パネルは HER-2/neuのでSKBR3細胞共培養後にP369-特異的T細胞（赤）または5、10でFLU-特異的T細胞（青）、および15時間の溶解のレベルを示しています。各データ点は、三重測定の平均値（±SEM）である。結果は、3つの別々の実験を代表するものである。 パネルBは、抗原特異的溶解はFasをFasリガンドの相互作用によるものではない実証P369特異的T細胞または非特異的活性化T細胞によってSKBR3の溶解を示す。黒いバーは、共培養を表しているFasリガンド抗体を含有していた。各バーは、T細胞の添加後5時間で三連の平均（±SEM）溶解です。結果は、3つの別々の実験を代表するものである。 パネルCは、10時間P369特異的T細胞によるSKBR3のT細胞の添加後溶解を示すHLAクラスI依存である。 HLA-クラスIブロッキングまたはアイソタイプコントロールのいずれかを共培養時に追加されました。各バーは三連の平均（±SEM）溶解です。この実験は、同様の結果で二回繰り返した。 パネルDは、10時間P369特異的T細胞による、いくつかのHLA-A2 +、HER-2/neu-expressing腫瘍細胞系のT細胞を添加した後％溶解を示す。 BT20、HLA-A2陰性乳癌細胞株を、陰性対照として用いた。各スポットは、3回の測定から計算されたユニークな実験を表しています。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。 <img src = "/ files/ftp_upload/3683/3683fig4.jpg" alt = "図4" /> 図4。インピーダンスに基づくアッセイは、腫瘍抗原特異的T細胞の検出のためのクロム放出アッセイよりも敏感である。示さ腫瘍およびT細胞続いて5時間後に測定されたP369-特異的T細胞の濃度を変化させることに応答して、SKBR3％の溶解されインピーダンスに基づくアッセイおよびクロム放出アッセイの両方を使用して混合。各シンボルは、次の3つの平均（±SEM）複製です。結果は、3つの別々の実験を代表するものである。 図5。インピーダンスに基づくT細胞傷害性アッセイの変動％のアッセイ内係数を示すが、抗原特異的T細胞の濃度範囲にわたってSKBR3の溶解の変動の平均値（±SD）％アッセイ内の係数である。各シンボルは、3つの複製の平均である。グラフに示される数字はトンです彼は、％CVを意味しています。 はめ込みパネルが P369-377特異的T細胞の濃度を変えるにSKBR3の平均（±SEM、n = 3）で％溶解を、示しています。 2つの別々のドナーからのT細胞を用いて二つの独立に生成されたP369-特異的T細胞株が示されている。