קביעת פעילות ציטוטוקסית אופטימלית של CD8 תאי T ספציפי אדם Her2neu על ידי השוואת Assay שחרור Cr51 למערכת xCELLigence

1. דור של CD8 T שורות תאים אנושי אנטיגן הספציפיים לזמן קצר 7 תאים נפרדים דם היקפי (mononuclear PBMCs) מהדם של תורמים בריאים נורמלים HLA-A2 חיוביים באמצעות Ficoll-Paque פלוס. הוסף 2 מ"ל / היטב PBMCs ל6 גם צלחות ב2 x 10 6 תאים / מ"ל. הוסף HER-2/neu HLA-A2-p369-377 מחייב פפטיד (KIFGSLAFL רצף חומצות האמיניות) או HLA-A2-מחייב שפעת P58-66 פפטיד (GILGFVFTL) ישירות לבארות בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​והמקום בחממה ב 37 ° C עם 5% CO 2. כדי לעזור לעורר ולהרחיב את תאי T, להוסיף, כל 2 ימים, 250 תקשורת μl / גם טרי בתוספת IL-2 האנושי רקומביננטי (מניות: 50 יחידות / μl) כדי להשיג ריכוז סופי של 50 יחידות / מ"ל ​​בתקשורת ובתרבות. Re-לגרות את תאי התרבות עם 2 x 10 6 תאים / מ"ל PBMCs אוטולוגי מוקרן פעמו למשך 2 שעות עם 10 מיקרוגרם / מ"ל של אותם פפטידים להשתמשד בשלב 1.3 ולהוסיף תאים אלה לתרבויות במ"ל / גם שבוע לאחר גירוי הפפטיד הראשון 1. הוסף מדיה אנושית רקומביננטי IL-2 ורעננה, כפי שמתוארת בשלב 1.4, לתרבויות הקיימות כל 2 ימים. Re-לגרות את התאים עם פפטיד PBMCs אוטולוגי והמוקרן כמתואר בשלב 1.5 שבוע לאחר גירוי הפפטיד השני. הכן להשתמש בתאים שישה ימים אחרי מחדש גירוי האחרון בבית המוקדם. 2. הכנת תאי סרטן השד מקם את תחנת מדידת עכבת xCelligence (תחנת xCelligence) בחממה ב 37 ° C עם 5% CO 2. קציר תאי אדם סרטניים (SKBR3, BT20, MCF7 או HCC1419) כי הם מחוברות 75% באמצעות טריפסין 0.25% וצנטריפוגה (1,000 סל"ד במשך 5 דקות). ספירת תאים סרטניים באמצעות hemocytometer ולשקם אותם בתקשורת סרטניים RPMI (בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -500 יחידות / מ"לIFN-gamma) בריכוז של cells/100 μl 7.5 x 10 3 גידול. תכנית תוכנת xCelligence על ידי הקמת דף הפריסה כדי לקבוע פריסה היטב ועל ידי הקמת דף לוח הזמנים כדי לקחת קריאות עכבה כל 5 דקות לתקופה 40 שעות ביממה. במשך 18 השעות הראשונות, מערכת xCelligence תיקח קריאות עכבה של תאים הסרטניים בלבד. הוסף 100 μl של מדיה סרטניים RPMI לxCelligence E-צלחות ולבצע רקע קריאה על ידי מדידת עכבה בהעדר תאים. הוסף תאים סרטניים לדואר הצלחות ב100 μl לכל טוב ומקום בתחנת xCelligence. לחץ על כפתור ההפעלה על תוכנת xCelligence להתחיל לקחת קריאות עכבה של תאים הסרטניים, שמייד מתחילים הקפדה על הלוחות אלקטרוניים. 3. תרבות משותפת של גידול עם CD8 תאי T ברגע שהתאים הסרטניים יש מצורפים והוכפלו לרמה של 1.5 x 10 4 תאים סרטניים לכל גם (approximately 18 שעות לאחר ההתחלה להיות מצופה), תאי T קציר הכינו בסעיף 1 על ידי גירוד ותסיסה עדינים צנטריפוגה ב 1000 סל"ד במשך 5 דקות ולספור תאי T באמצעות hemocytometer ולשקם אותם בתקשורת RPMI עם FBS 10% ביחסים שונים, החל משעת יחס מרבי של תאים סרטניים 1 עד 40 תאי T ולדלל פי 2 עד יחס של תא 1 גידול לרמה של 1.25 תאי T הוא הגיע. לדוגמה, יש 1.5 x 10 4 תאים סרטניים בכל טוב. כדי להשיג יחס 1:40, להוסיף 6 x 10 5 תאי T לכל טוב ולדלל את תאי T של פי 2 עד יחס של 1.5 x 10 4 תאים סרטניים ל1.875 x 10 4 תאי T בכל טוב (1:1.25 יחס) מושגת. להשהות את תחנת xCelligence ולהסיר דואר הצלחת. הסר את המדיה בבארות עם pipet ולהוסיף 200 μl של מדיה לבד או היחס המתאים של תאי T לבארות. הנח את דואר הצלחת בחזרה בתחנת xCelligence ולהמשיך פרו תוכנת xCelligenceכך גרם קריאות עכבה נלקחות כל 5 דקות במשך כ 20 שעות לאחר בנוסף תא T. לנרמל את התוצאות בסופו של הדבר של assay. 4. כרום שחרור assay (CRA) 7 עקוב נהלי בטיחות קרינה מוסדיים בעת עבודה עם 51 Cr ו51 תאי יעד Cr-שכותרתו. תמיד להשתמש במיגון מתאים כדי להפחית את החשיפה לקרינה. תאים סרטניים דופק עבור 2 שעות 1 x 10 6 תאים / מ"ל סרטניים עם 10 51 Cr הטרי μl / מ"ל (0.005 Ci / מ"ל). לשטוף את התאים סרטניים ב10 מ"ל של תקשורת RPMI עם FBS 10% ו צנטריפוגות ב 1000 סל"ד במשך 5 דקות. הוסף תאים סרטניים לצלחת 96 היטב מסביב לתחתית ב1 x 10 5 תאים סרטניים ב100 μl / כן. הוסף תאי T ביחסים שונים, החלו בתא גידול 1 עד 40 תאי T ולדלל פי 2 עד יחס של 1 ל -1.25 תאים סרטניים ותאי T מושגת. לדוגמה, יש 1 x 10 5 תאים סרטניים בכל טוב. כדי להשיג יחס 1:40, להוסיף 4 x 10 6 תאי T לכל טוב ולדלל את תאי T של פי 2 עד יחס של 1 x 10 5 תאי גידול לרמה של 1.25 x 10 5 תאי T בכל טוב (1:1.25 יחס) מושגת. הוסף פקדי תאים סרטניים ספונטניים ומקסימום לצלחת. על מנת לחשב את השחרור הספונטני של 51 Cr מתאי הגידול, להוסיף שש בארות המכילים כל אחד מהם x 10 5 תאים סרטניים 1 ב100 עד 100 μl μl של תקשורת RPMI עם FBS 10%. כדי לחשב שחרור מרבי של 51 Cr מתאי הגידול, להוסיף שש בארות המכילים כל אחד מהם x 10 5 תאים סרטניים 1 ב100 μl עד 100 טריטון 0.1% μl X-100 ב PBS, שlyses כל התאים. דגירה הצלחות במשך 5 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. לאחר דגירה, להסיר 50 μl של supernatant מכל טוב ולהוסיף אותו לצלחת לומה. ייבש את צלחות לילה ולמדוד CPM באמצעות מונה גמא. "חישוב תמוגה> 5. אחוז le assay עכבה: קח קריאת העכבה, כפי שדווחה במדד התא (CI), בנקודות זמן שונות, ולהשתמש בנוסחא הבאה כדי לקבוע תמוגה אחוזים: (גידול CI בלבד – (CI + T תאים סרטניים)) (גידול CI בלבד) / * 100. CRA: השתמש בנוסחא הבאה כדי לקבוע תמוגה אחוזים: (CPM הניסיוני – ספונטני CPM) / (CPM מרבי – ספונטני CPM) * 100. 6. נציג תוצאות תאי T לבד לא להגדיל את העכבה תאי T, באופן כללי, לא לדבוק במשטחים המוצקים ביותר ואינם דורשים היצמדות לצורך ההפעלה והשגשוג. לכן, זה היה שיערותיו שתאי T לא צריכים לתרום לעכבה על xCelligence E-הצלחות. כדי לבחון זאת, בארות הועמסו עם או SKBR3 תאי סרטן שד או טרי מטוהר אדם CD8 תאי T. עכבה נמדדה במשך 40 שעות וdemonst דוגמה מייצגתדירוג השפעה מועטת במהות של תאי T מוצגת באיור 1 א. לעומת זאת, ניתן לטעון כי תאי T עשויים להפחית עכבת רקע, אם כי רק במעט. למרות זאת, התרבות משותפת גילתה כי התהליך של הוספת תאי T ב18 שעות לאחר תחילת מדידות עכבה הביא לשיבוש עכבה (איור 1). מחקרים אחרים גילו כי שיבושים נבעו בחלקו לטיפול שכן ההפחתה באות יכולה להיות מופחת על ידי הבטחת הטמפרטורה של התמיסה המכילה תאי T היה אותו הדבר כמו הפנים של החממה. ירידות בתיווך עכבה על ידי תאי T הן תלויות מינון. השירות של assay עכבה מבוסס להשוות דגימות לפעילות תא T ציטוטוקסי דורש את היכולת להבחין בין ריכוזים של תאי T אנטיגן ספציפיים שונים. כדי לבדוק אם זה אפשרי, תאי SKBR3 היו שיתוף תרבותיים עם משתנה ריכוזtions של תאי T נגזר משורת תאי T HER-2/neu הספציפית p369. כפי שמוצג באיור 2 א, ירידה בעכבה היו תלויה במינון של תאי T. מראה איור 2 כי המדדים בתא 10 שעות אחרי פולינום מסדר השנייה פשוט על פני הטווח של תאי T. לפיכך, תחנת xCelligence מנטרת CD8 מות תא T תיווך של SKBR3 גידולים בזמן אמת כמו ירידה במדד תא. Assay עכבה מבוסס תאי T מזהה אנטיגן ספציפי כדי לקבוע אם ירידה בעכבה של SKBR3, שהוא קו HER-2/neu וHLA-A2 חיובי לסרטן שד תאים סרטני, על ידי תאי T HER-2/neu p369 ספציפיים היו אנטיגן ספציפיים, בארות נפרדות המכילות גם SKBR3 הודגרו עם תאי T הנגזרים משורת תאי T שפעת (שפעת) ספציפית. התאים ספציפיים-T השפעת שימש כביקורת שאינה ספציפית, להיות HLA-A2 חיובי, אך לא נתקל בכל יכולת לזהות HER-2/neu. כפי שניתן לראות באינטרנט אלחוטיgure 3, יש הבדל משמעותי בין הפעילות של ממס HER-2/neu תאי T-p369 ספציפיים, בהשוואה לתאי T ספציפי לשפעת (p <0.0001). במקרים מסוימים, תאי T לא ספציפיים לגידול (למשל שפעת ספציפית או anti-CD3/anti-CD28 מגורה) הפגינו רמת פעילות נמוכה ממס (איורים 3A-B). תאי T יכולים להרוג באחת משתי דרכים, או שאינם דווקא דרך פאס: אינטראקציות יגנד פאס או אנטיגן ספציפי באמצעות שחרורו של granzymes וperforins. כדי להמשיך לאשש את הרעיון שתאי T הורגים HER-2/neu-specific באופנת אנטיגן ספציפית, אנחנו שולבו נוגדן חסימה ליגנד פאס. כפי שניתן לראות באיור 3 ב, הנוגדן לא הפחית את הפעילות של ממס HER-2/neu תאי T-p369 ספציפיים. הנוגדן יכול לעכב אינטראקציות בין פאס ויגנד FAS, כפי שמודגם בתאי T שהופעלו הלא במיוחד עם anti-CD3/CD28 חרוזים. תוצאות אלו מצביעות על כך שכאשרתאי T ספציפיים לגידול נבדקו עם תאי T שאינם ספציפיים לגידול, מצור יגנד פאס עשוי להיות נחוץ כדי להפחית את אינטראקציות תיווך הלא TCR למינימום. לחלופין, בעת שימוש בקווי T בתרבית תאים לזמן הקצר שבו רק חלק קטן מתאי T ספציפי לאנטיגן משמש לייצור vivo לשעבר, את האפשרות של הפעלת תא T אי התאמה בתיווך MHC יכולה להתרחש מובילה לתמוגה שאינן ספציפית. במקרה זה, התוספת של נוגדנים החוסמים את HLAs לא רלוונטי עשויה להיות מוצדקת. כדי לקבוע אם תאי T-p369 הספציפיים הורגים תאים סרטניים בכיתת HLA נוספו לי באופן תלוי, או נוגדנים שאני אנטי HLA-כיתה או נוגדן שליטת אלוטיפ לשיתוף התרבויות. כפי שניתן לראות באיור 3 ג, תמוגה על ידי תאי T-p369 ספציפיים דוכא על ידי הכללתו של הנוגדן מדגימה HLA כיתה אני הגבלה. לבסוף, מאז הפיתוח של assay זה היה במידה רבה לעשות זאת באמצעות SKBR3, היה חשוב לברר אם חסיד אחר HLA-תאים סרטניים המבטאים A2 וHER-2/neu יכלו להיהרג על ידי תאי T-p369 ספציפיים. כך, תאי T היו מוכנים והוסיפו ביחס 01:05 לתאים סרטניים HER-2/neu-expressing HCC1419 תאי HLA-A2, וSKBR3, MCF-7, ו. שורת תאי הגידול השלילית HLA-A2, BT20 שימש כביקורת שלילית. כפי שניתן לראות באיור 3D, כל תאים סרטניים נוספים אלה, למעט BT20 נהרגו גם כפי שהוערך על ידי עכבה. לכן, השיטה שנראה שימושית לתאים סרטניים חסיד מספר היעד. Assay עכבה מבוסס הוא רגיש יותר מassay שחרור הכרום הסטנדרטי באיתור פעילות תא T ציטוטוקסי (51 Cr) assay שחרור הכרום (CRA) המודד את פעילות cytolytic כבר זמן רב את תקן הזהב שבאמצעותו לעקוב אחר תגובות תא T CD8. ב assay זה, תאי היעד (תאים סרטניים למשל) מסומנים עם 51 Cr. ברוב המקרים, תאי היעד בריאים יכולים לשמור על רובradiolabel במהלך assay. CD8 תאי T מתווספים לתאי המטרה, בדרך כלל בריכוזים שונים, והרג של תאי המטרה הוא זוהה על ידי שחרורו של 51 Cr לתוך המדיום. מלבד העובדה שהוא משתמש בקרינה מסוכנת, שתי בעיות עיקריות עם CRA הן חוסר הרגישות וכי assay בדרך כלל דורש כמויות גדולות של תאי T CD8, להגביל את התועלת שלו. כדי לקבוע אם assay עכבה מבוסס היה רגיש יותר CRA, HER-2/neu תאי T-p369 הספציפיים נוצרו במבחנה ויישומי, בכמויות משתנות, לאו E-צלחות המכילות תאים סרטניים ללא תווית או צלחות פוליפרופילן רגילות המכילות 51 Cr שכותרתו תאי המטרה. מדידות, או כרום עכבה או בחינם, נמדדו ב5 שעות לאחר בנוסף תא T. איור 4, דוגמה מייצגת, תערוכות assay העכבה בביצועיו על שחרורו הכרום. הווריאציה התוך assayשל assay עכבה מבוסס הוא בדרך כלל מתחת ל -20%. וריאציה התוך assay נבחנה, מאז שימוש רחב יותר של assay זה ייקבע במידה רבה על ידי reproducibly והווריאציה (איור 5). שתי שורות תאי T-p369 ספציפיות נוצרו באופן עצמאי זה מזה 30 ימים והוסיפו בשלושה עותקים על פני טווח של תאים סרטניים לתאי T יחסים. גרף הבלעה באיור 5 מראה כי הקווים היו במידה רבה מקביל במונחים של lysing SKBR3 תאים. מקדם% מוריאציה שיחושב לכל תא ויחס זמם. כפי שניתן לראות באיור 5, בין 1:40 ויחסים 1:05 מקדמי% של שונות (CV) היו מתחת ל -15%. ב1:2.5 ו1:1.25, עם זאת, את קורות החיים היו גבוהים או בלתי צפויים. בגלל שונות ביולוגית נרחבות, שלא ניתן למדוד את ההשתנות בין assay-עם שורות תאי T ראשוניות. <br /> איור 1. עכבה צריכה להיות מנורמלת בעקבות התוספת של תאי T. פנל: מראה כי תאים סרטניים (קו אדום) ולא תאי T (קו כחול) הם אחראים לעכבה. מוצגים הם את העתקי העכבה מעל 40 שעות לתאים סרטניים או או לא לבד. תוצאות דומות התקבלו מניסוי שני. שימו לב שאות הפרעות בכ 20 שעות מייצגת את נקודת תוספת של תאי T לבארות שאינו מכילות תאים סרטניים B פנל:. מראה כי מדידות עכבה הם שיבשו transiently עם התוספת של תאי T לתאים סרטניים. זה דורש נורמליזציה בנקודת זמן לאחר התוספת של תאי T (נקודה של נורמליזציה מסומנת בגרף ראה). עקבות מורכבות מנקודות נתונים כפולות. העקבות לתאים סרטניים בלבד מוצגת באדום. את העקבות האחרות לייצג את התאים סרטניים שיתוף תרבותי עם HER-2/neu תאי T-p369 ספציפי (כחול: יחס של 1.25 תאי T / תא גידול, גרין:יחס של 40 תאי T / תאים סרטניים). כל זכר מחושב מנקודות נתונים כפולות נאספו כל 5 דקות את משך דרך התרבות. תוצאות הן נציג של 3 ניסויים נפרדים. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה. איור 2. הירידה בתיווך עכבה על ידי תאי T היא תלויה במינון. פנל: המוצגים הם את עקבות העכבה של SKBR3 תאים סרטניים טופחו לבד או עם ריכוזים שונים של תאי T ספציפיים לגידול. כל זכר מחושב מנקודות נתונים שנאספו בשלושה עותקים כל 5 דקות את משך דרך התרבות. תוצאות הן נציג של 3 ניסויים נפרדים לוח ב ':. הראה הם המדדים בתא 10 שעות על פני כל תא T / גידול ריכוזים סלולריים. הקו המקווקו מייצג את מדד התא לתאים סרטניים alאחד. כל סמל הוא ממוצע (± SEM) של קביעות בשלושה עותקים. תוצאות הן נציג של 3 ניסויים נפרדים. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה. איור 3. Assay מבוסס העכבה מזהה תגובות תא T ציטוטוקסיים אנטיגן ספציפיות. לוח מראה את רמת של תמוגה SKBR3 תאים על ידי תאי HER-2/neu p369-T ספציפיים (אדום) או תאי T ספציפיים לשפעת (הכחול) בשעת 5, 10, ו -15 שעות לאחר התרבות המשותפת. כל נקודת נתונים היא ממוצעת (± SEM) של מדידות בשלושה עותקים. תוצאות הן נציג של 3 ניסויים נפרדים. לוח ב 'מראה תמוגה של SKBR3 על ידי תאי T-p369 ספציפיים או תאי T שאינם מופעלים באופן ספציפי, הוכחה כי תמוגה אנטיגן הספציפית אינה בשל לאינטראקציות יגנד FAS-FAS. פסים שחורים מייצגים שיתוף תרבויות שהכיל נוגדני יגנד פאס. כל עמודה הוא תמוגה הממוצעת (± SEM) בשלושה עותקים ב5 שעות לאחר התוספת של תאי T. תוצאות הם נציג של 3 ניסויים נפרדים. לוח ג מראה תמוגה 10 שעות לאחר תוספת של תא T SKBR3 על ידי תאי T-p369 ספציפיים היא ברמת HLA אני תלוי. כך או HLA-כיתה אני חסימה או שליטת אלוטיפ נוספה במהלך התרבות משותפת. כל עמודה הוא תמוגה (± SEM) הממוצעת בשלושה עותקים. הניסוי הזה חזר על עצמו פעמיים עם תוצאות דומות. לוח ד ניתן לראות% תמוגה 10 שעות לאחר תוספת תא T של מספר +, שורות תאי HLA-A2 HER-2/neu-expressing גידול על ידי תאי T-p369 ספציפיים. BT20, שורת תאי סרטן שד HLA-A2-שלילית שימש כביקורת שלילית. כל נקודה מייצגת ניסוי ייחודי מחושב מקביעות בשלושה עותקים. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. <img srג alt = "/ files/ftp_upload/3683/3683fig4.jpg" > איור 4. Assay מבוסס העכבה הוא רגיש יותר מassay שחרור הכרום לצורך זיהוי של תאי T אנטיגן ספציפיים לגידול. מוצגים הם תמוגה% מSKBR3 בתגובה לריכוזים שונים של תאי T-p369 ספציפיים, כפי שנמדד ב5 שעות לאחר גידול ותא T ערבוב הן באמצעות assay עכבה מבוסס וassay שחרור הכרום. כל סמל הוא ממוצע (± SEM) של שלושה משכפל. תוצאות הן נציג של 3 ניסויים נפרדים. איור 5. מקדמי% תוך assay של וריאציה של assay cytotoxicity תא T עכבה מבוסס. המוצגים הם מקדמים ממוצעים (± סטיית תקן)% תוך assay של וריאציה בתמוגה של SKBR3 על פני טווח של ריכוזים של תאי T אנטיגן ספציפיים. כל סמל הוא ממוצע של שלוש חזרות. מספרים מוצגים בגרף הם לאהוא מתכוון לקורות%. פנל הבלעה מראה את תמוגה% מSKBR3, בריכוזים שונים של תאי T-377-p369 ספציפיים אומר (± SEM, n = 3). שתי שורות תאי T-p369 ספציפיות שנוצרו באופן עצמאי תוך שימוש בתאים T משני תורמים נפרדים מוצגות.