确定最佳人力Her2neu特异性CD8 + T细胞的细胞毒活性的比较CR51发行含量xCELLigence系统

1。短期人力抗原特异性CD8 + T细胞线7代独立的外周血单个核细胞（PBMC）从正常健康HLA-A2阳性献血者使用聚蔗糖帕克加的血。 对外周血单核细胞（PBMC）2毫升/加入到6孔板中以2×10 6细胞/ ml。 添加HLA-A2结合的HER-2/neu基因P369-377肽（氨基酸序列KIFGSLAFL的）或HLA-A2结合的流感P58-66肽（GILGFVFTL）直接到各孔中，在终浓度为10微克/毫升和地点在37℃用5％CO 2的培养箱中。 为了帮助刺激和扩大T细胞，添加，每2天，250微升/孔重组人IL-2（库存：50单位/μl）来实现的最终浓度为50单位/毫升培养基中的新鲜培养基。 再次刺激培养细胞与2×10 6个细胞/毫升照射的自体PBMCs 10微克/毫升的相同的肽脉冲2小时，用D在步骤1.3和添加这些细胞以1ml /孔的第一肽刺激后一周的文化。 添加人重组IL-2和新鲜的培养基，步骤1.4中所描述的，到现有的文化，每2天。 重新刺激细胞如上述步骤1.5一个星期后的第二个肽刺激的自体PBM​​Cs肽和照射。 准备使用6天之后，最后再刺激的最早的细胞。 2。乳腺癌细胞的制备放置的的xCelligence阻抗测量站（站xCelligence）的培养箱中，在37℃，5％CO 2。 收获的人类肿瘤细胞（SKBR3，BT20，MCF7或HCC1419），75％融合时，用0.25％胰蛋白酶和离心分离（1000转，5分钟）。 肿瘤细胞计数，使用血球和重组在RPMI肿瘤介质（补充有10％胎牛血清（FBS）和500个单位/毫升IFN-γ）的浓度为7.5×10 3肿瘤cells/100的微升。 计划的xCelligence软件通过设置布局页面来确定井布局和设置时间表页面阻抗读数40小时内每隔5分钟。 xCELLigence系统的最初18小时内，将采取的肿瘤细胞的阻抗读数。 加入100微升的RPMI肿瘤媒体的xCelligence E-板和执行的背景下，通过测量阻抗的细胞在没有读取。 添加到E-板的肿瘤细胞在每以及和地方在xCelligence站的100微升。 按下启动按钮用xCELLigence软件开始服用的肿瘤细胞，立即开始坚持到E板的阻抗读数。 3。 CD8 + T细胞共培养肿瘤一旦肿瘤细胞附着并倍增至1.5×10 4个肿瘤细胞，每孔（近似mately 18小时后收获T细胞最初被镀），第1节轻轻地刮取和搅拌离心机以1,000 rpm 5分钟的计数使用血球和含10％FBS的RPMI培养基中的重组他们在不同的比率，从1肿瘤细胞进行最大比40 T细胞和T细胞的比例为稀释2倍，直到达到1肿瘤细胞的到1.25 T细胞的。例如，有1.5×10 4个肿瘤细胞，每孔。为了达到1:40的比例，添加每孔6×10 5个T细胞，并稀释2倍，直到T细胞的比例为1.5×10 4个肿瘤细胞，以1.875×10 4 T细胞，每孔（1:1.25的比例）的实现。 暂停xCelligence站和删除的E盘。 用移液管的孔中取出介质，并添加200μl的媒体单独或孔的T细胞的合适比例。 将E-板背面在xCelligence站，并继续xCelligence软件Pro克阻抗读数采取T细胞除了约20小时后，每5分钟。 规范化结束时的测定结果。 4。铬释放实验（CRA）7 按照机构辐射安全程序工作时，与51 Cr和51 Cr标记的靶细胞。始终使用适当的屏蔽，以减少辐射暴露。 脉冲肿瘤细胞2小时，在1×10 6个肿瘤细胞/毫升，10微升/毫升的新鲜的51 Cr（0.005次/毫升）。 肿瘤细胞洗净，在10毫升的RPMI培养基含10％FBS，离心5分钟，以1,000 rpm。将肿瘤细胞在96 -孔圆形底板中的100μl/孔，并以1×10 5个肿瘤细胞。 添加各种比例，1肿瘤细胞开始到第40的T细胞的T细胞，并稀释2倍，直到1 1.25 T细胞的肿瘤细胞的比率来实现的。例如，有1×10 5个肿瘤细胞每口井。为了达到1:40的比例，每孔加入4×10 6个T细胞，并稀释2倍，直到T细胞的比例为1×10 5个肿瘤细胞，以1.25×10 5个T细胞，每孔（1:1.25的比例）的实现。 添加自发的和最大的肿瘤细胞控制的板块。为了计算从肿瘤细胞自发释放的51 Cr，添加六口井每片含1×10 5个肿瘤细胞在100μl100μl的RPMI培养基含10％FBS。来计算最大释放的51 Cr从肿瘤细胞中，添加六口井每片含1×10 5个肿瘤细胞，在100微升至100微升0.1％的Triton X-100的PBS中，所有细胞裂解。 用5％的CO 2，在37℃下孵育5小时的板。 培养后，从每个孔中取出50微升上层清液，并把它添加到亮度板。 干板过夜，使用γ计数器测量CPM。 乐“> 5。裂解百分比计算阻抗测定：取细胞指数（CI）报道，在不同时间点的阻抗阅读，使用下面的公式来确定％溶解：（CI肿瘤 – （CI肿瘤的T细胞））/（CI肿瘤） * 100。 CRA：使用下面的公式来确定％溶解：（CPM实验 – CPM自发）/（CPM的最大 – CPM自发）* 100。 6。代表结果 T细胞本身不增加阻抗在一般情况下，T细胞，不坚持最坚实的表面，并不要求遵守活化和增殖。因此，有人推测，T细胞不应该有助于阻抗用xCELLigence E-板。为了测试这一点，井装载任何SKBR3乳腺癌细胞或新鲜纯化的人CD8 + T细胞。超过40小时的过程，一个代表性的例子演示如何测量阻抗图1A中所示的评估基本上是T细胞的影响不大。相反，它可以说，T细胞可能减少背景阻抗，虽然只是轻微。尽管如此，共培养后，增加T细胞在18小时后启动阻抗测量的过程中导致的阻抗中断（ 图1B）。其他的研究显示，中断是由于在确保的T细胞的溶液的温度，就可以减少因为缩减信号处理部分相同的孵化器内部。 由T细胞介导的​​阻抗减少是剂量依赖性的。 基于阻抗的测定样品的细胞毒性T细胞的活性进行比较的实用程序需要不同浓度的抗原特异性T细胞之间的分辨能力。为了测试是否这是可能的，人乳腺癌SKBR3细胞与不同浓度的共培养从HER-2/neu的P369特异性T细胞的T细胞衍生的蒸发散。如在图2A中所示，减少阻抗依赖于T细胞的剂量。 如图2B所示，在10小时的细胞指数T细胞的范围内按照一个简单的二阶多项式。因此，xCelligence站CD8 T细胞介导的​​死亡SKBR3肿瘤细胞指数下降实时监控。 的阻抗为基础的检测中检测到抗原特异性T细胞要确定是否由HER-2/neu的阻抗减少，这是一个HER-2/neu和HLA-A2阳性的乳腺癌肿瘤细胞系，人乳腺癌SKBR3 P369特异性T细胞抗原孵育特定的，独立的孔中SKBR3与来自流感（FLU） – 特异性T细胞系的T细胞。流感特定的T细胞作为一种非特异性的控制，HLA-A2阳性，但没有任何能够识别HER-2/neu的。如图中所示的网络连接3 GURE，有FLU-特异性T细胞（P <0.0001）相比，是一个显着的区别HER-2/neu基因P369特异性T细胞的溶解活性。在某些情况下，不特定的肿瘤的T细胞（例如，FLU特定或anti-CD3/anti-CD28的刺激）溶解活性（ 图3A-B）展示了一个较低的水平。 T细胞可以杀死两种方式之一，无论是通过Fas非特异性：Fas配体的相互作用或抗原 – 特别是通过释放颗粒酶和穿孔素。为了进一步证实，HER-2/neu-specific T细胞在抗原特异性的方式杀死的概念，我们将阻塞的抗Fas配体抗体。 如图3B中所示，该抗体的HER-2/neu基因P369特异性T细胞的溶解活性并没有降低。该抗体能抑制Fas和Fas配体之间的相互作用，表现出与T细胞非特异性激活淋巴球珠。这些结果表明，当肿瘤特异性T细胞与非肿瘤特异性T细胞，Fas配体的封锁测试，可能需要在最低限度，以减少非T细胞受体介导的相互作用。可选地，当使用短期培养的T细胞线，其中只有一小部分的T细胞用于体外生成的特定的抗原，MHC不匹配介导的T细胞的活化的可能性可能发生的非特异性裂解。在这种情况下，除了不相关的HLA的抗体，阻止可能被担保。 ，以确定是否P369特异性T细胞，杀伤肿瘤细胞的余依赖性，无论是抗-HLA-I类抗体或同种型对照抗体加入到共培养中的HLA类。 图3C中所示，裂解由P369-特异性T细胞的抑制夹杂物的抗体展示HLA-I类限制。最后，由于使用SKBR3的发展主要是做这个实验，这是重要的，以确定是否其他附着HLA-A2和HER-2/neu表达的肿瘤细胞P369特异性T细胞可杀死。因此，制备的T细胞的HLA-A2和HER-2/neu-expressing肿瘤细胞，人乳腺癌SKBR3，MCF-7和HCC1419细胞以1:5的比例加入。 BT20的HLA-A2阴性的肿瘤细胞系，用作为阴性对照。所示图3D，所有这些额外的肿瘤细胞，除了BT20也被杀害了所评估的阻抗。因此，该方法似乎，多个目标粘附肿瘤细胞是有用的。 基于阻抗的测定是比标准铬释放测定在检测细胞毒性T细胞的活性更加敏感铬（51铬）释放法（CRA）的措施杀伤活性长期以来一直是黄金标准来监测CD8 + T细胞应答。在该试验中，用51 Cr标记的靶细胞（如肿瘤细胞）。在大多数情况下，健康的靶细胞可以保留大部分的在检测过程中的放射性标记。被添加到CD8 + T细胞的靶细胞中，通常会在不同的浓度，和杀死靶细胞检测到培养基中释放的51 Cr的 。除了事实，即它使用危险的辐射，与CRA的两个主要问题是缺乏敏感性的测定法通常需要大量的CD8 T细胞，限制了它的实用程序。要确定阻抗为基础的检测更敏感，比HER-2/neu的CRA，P369特异性T细胞在体外和应用产生，数额不等，任E板含有未标记的肿瘤细胞或标准的聚丙烯板51 Cr标记的靶细胞。的测量，阻抗或自由铬，测定在5个小时后，T细胞此外，一个代表性的例子， 图4示出的阻抗测定法优于铬释放。 批内变异阻抗为基础的检测通常是在20％以下。 批内的变化进行了检查，在此检测中，因为更广泛的使用，将在很大程度上取决于它的可重复而变化（ 图5）。独立生成两个P369特异性T细胞系，间隔30天，并一式三份的增加，在一个范围内的肿瘤细胞在T细胞的比率。 图5中的曲线图的插图示出的线在大致相当于在SKBR3细胞溶解。变异系数（％）在每个细胞的比率计算，并绘制。如在图5中示出，1:40和1:5比率％的变异系数（CV）为15％以下。然而，在1:2.5和1:1.25的CV高或不可预知的。由于广泛的生物学变异，它是不可能测量批间变异的主要的T细胞系。 <br /> 图1。阻抗需要的另外的T细胞进行归一。 A组：表明，肿瘤细胞（红色线）和T细胞（蓝线）是负责的阻抗。阻抗描超过40小时为肿瘤或T细胞。从第二个实验中获得相似的结果。请注意，在约20个小时的信号扰动代表点的另外的T细胞不含有肿瘤细胞的孔，B组：示出阻抗测量的另外的T细胞对肿瘤细胞的瞬时中断。这需要归一化的另外的T细胞后，在某个时间点（参见图中标记点的归一化）。痕迹是由重复的数据点。肿瘤细胞本身的跟踪显示为红色。其他的痕迹代表肿瘤细胞共同培养与HER-2/neu基因P369特异性T细胞（蓝色：1.25 T细胞/肿瘤细胞，格林比：40个T细胞/肿瘤细胞）的比例。每个跟踪通过的持续时间的培养物收集每5分钟重复数据点计算。结果是代表3个独立的实验。 点击这里查看大图 。 图2。减少由T细胞介导的阻抗是剂量依赖性的。 A组：显示的是单独或与不同浓度的肿瘤特异性T细胞的肿瘤细胞培养人乳腺癌SKBR3阻抗的痕迹。通过每5分钟收集培养的持续时间的一式三份的数据点计算出每个跟踪。结果有代表性的3个独立的实验B组：显示的是的细胞指数跨越所有的T细胞/肿瘤细胞浓度在10小时。而虚线表示的人肿瘤细胞的细胞指数为一个。每个符号是三次重​​复测定的平均值（±标准差）。结果是代表3个独立的实验。 点击这里查看大图 。 图3。基于阻抗的测定法检测抗原特异性细胞毒性T细胞应答。面板A显示HER-2/neu的P369-特异性T细胞（红色）或共培养后的FLU-特异性T细胞（蓝色）5，10，和15小时的SKBR3细胞的裂解水平。每个数据点的平均（±SEM）一式三份测量。结果代表3个独立的实验面板B显示了人乳腺癌SKBR3 P369特异性T细胞或者非特异性激活的T细胞的裂解，证明该抗原特异性裂解是不是由于Fas的Fas配体的相互作用。黑条代表共同培养载有Fas配体抗体。每个长条的平均值（±标准差），在5小时后，加入T细胞一式三份的裂解。结果有代表性的3个独立的实验。 面板C显示了10小时后，T细胞SKBR3此外P369特异性T细胞的裂解是HLA-I类依赖。无论是HLA-I类阻塞或同型对照共同培养过程中加入。每个酒吧是在一式三份的平均（±SEM）裂解。实验重复2次，具有相似的结果。 图D显示了几个HLA-A2 +，HER-2/neu-expressing肿瘤细胞系P369特异性T细胞的T细胞加入10小时后的％裂解。 BT20，HLA-A2阴性乳腺癌细胞系作为阴性对照使用。从三次测量计算每个点代表一个独特的实验。 点击这里查看大图 。 <img src ="“所有/" filesftp_upload36833683fig4.jpg”alt ="“图4”/"> 图4。的阻抗为基础的分析是比铬释放法检测肿瘤抗原特异性T细胞的检测更敏感。显示的是人乳腺癌SKBR3％溶解在不同浓度的P369-特异性T细胞，肿瘤细胞和T细胞后，在5小时内计量混合使用基于阻抗的测定法和铬释放测定。中各符号是三次重​​复的平均值（±标准差）。结果是代表3个独立的实验。 图5。 ％批内的变异系数的基于阻抗的T细胞的细胞毒性测定。显示的是平均值（±SD）％批内的变异系数在一个范围内的浓度的抗原特异性T细胞在人乳腺癌SKBR3溶解。每个符号是重复三次的平均值。图中显示的数字是t他的意思是％的CV。 插入面板显示的平均（±SEM，N = 3％）裂解SKBR3，P369-377特异性T细胞在不同浓度的。示两个独立产生的P369特异性T细胞系，使用两个单独的供者的T细胞的。