Transfert de gènes à l'oreille de souris en développement intérieur par<em> In Vivo</em> Électroporation

L'oreille des mammifères intérieure dispose de 6 épithélium sensoriel distincte: 3 crêtes dans les ampoules des canaux semi-circulaires; macules de l'utricule et le saccule, et l'organe de Corti dans la cochlée enroulée. Le crêtes et macules contiennent des cellules ciliées vestibulaires que transduisent stimuli mécaniques servent les sens particulier de l'équilibre, tandis que les cellules ciliées auditives dans l'organe de Corti sont les principaux transducteurs pour entendre ^1. Spécification du destin cellulaire dans ces épithéliums sensoriels et de la morphogenèse des canaux semi-circulaires et la cochlée se déroulera durant la deuxième semaine de gestation chez la souris et sont en grande partie achevé avant la naissance ^2,3. Des études de développement de l'oreille de souris intérieure sont effectuées régulièrement par la récolte d'embryons transgéniques à différents stades embryonnaires ou postnatale afin de mieux comprendre la base moléculaire de cellulaire et / ou morphologique phénotypes ^4,5. Nous émettons l'hypothèse que le transfert de gène à l'oreille de souris en développement in utero intérieure </ Em> dans le contexte de gain de-et la perte de fonction des études représente une approche complémentaire à la transgenèse souris traditionnelle pour l'interrogation sur les mécanismes génétiques qui sous-tendent le développement des mammifères oreille interne ^6.

Le paradigme expérimental de mener des études dérégulation de gènes dans l'oreille interne de souris en développement ont démontré ici résout en trois étapes principales: 1) une laparotomie ventrale; 2) la microinjection transutérine et 3) électroporation in vivo. Laparotomie ventrale est une technique chirurgicale la survie des souris qui permet l'externalisation de l'utérus pour accéder expérimental aux embryons implantés ^7. Microinjection transutérine est l'utilisation de verre, biseautées micropipettes capillaires à introduire le plasmide d'expression dans la lumière de la vésicule otique ou otocyst. In vivo électroporation est l'application d'onde carrée, impulsions de courant pour diriger l'expression plasmide dans des cellules progénitrices ^8-10.

<p class = "jove_content"> Nous avons déjà décrit cette technique d'électroporation à base de transfert de gène et inclus des notes détaillées sur chaque étape du protocole ^11. Souris techniques expérimentales embryologiques peut être difficile à apprendre de la prose et les images fixes uniquement. Dans le présent travail, nous démontrons les 3 étapes de la procédure de transfert de gène. La plupart des critiques, nous déployons la microscopie vidéo numérique pour montrer précisément comment: 1) déterminer l'orientation embryon in utero; 2) réorienter embryons à des fins de ciblage des injections à l'otocyst; 3) micro-injection d'ADN mélangé avec un traceur colorant dans la solution otocyst aux jours embryonnaires 11,5 et 12,5; 4) électroporer la otocyst injecté, et 5) embryons d'étiquettes électroporés pour la sélection postnatale à la naissance. Nous fournissons des exemples représentatifs de succès transfectées oreille interne, un guide illustré sur les causes les plus courantes de mauvais ciblage otocyst; discuter de la façon d'éviter les erreurs communes méthodologiques et des lignes directrices actuelles pour l'écriture d'un in utero gène protocole de transfert des soins aux animaux.