بسيطة وقوية في الجسم الحي و في المختبر مدخل لدراسة الجمعية فيروس
Summary
وهناك طريقة بسيطة وفعالة وقوية لتزامن وصول عناصر فيروسية متعددة لخلايا النبات عن طريق<em> الأجرعية</emيوصف> بوساطة التعبير عابر. يتبع encapsidation هذا النهج هو قابل للدراسة تكرارها، من قبل<em> في المختبر</emالمنضب> إعادة التجميع من غير الفيروسية المكونات إلى الجينوم الفيروسي أشباح الضوئية مناسبة للتطبيقات الطبية الحيوية.
Abstract
في الفيروسات مع إيجابي، بمعنى الممرضة الجينوم الحمض النووي الريبي على البشر والحيوانات والنباتات، وencapsidation ذرية في virions ناضجة ومستقرة هي مرحلة الكاردينال خلال إنشاء عدوى في مجموعة معينة. وبناء على ذلك، ودراسة encapsidation يحل المعلومات المتعلقة الدراية لآلية تنظم الجمعية فيروس لتشكيل virions المعدية. مثل هذه المعلومات أمر حيوي في صياغة أساليب جديدة لكبح انتشار الفيروس والسيطرة على الأمراض. يمكن دراستها encapsidation الفيروس في والمجراة في المختبر. encapsidation الجينوم في الجسم الحي هو عملية منظمة للغاية الانتقائية التي تنطوي على تفاعلات الجزيئات التحت خلوية والتقسيم. لذلك، مما يؤدي إلى دراسة تشريح أحداث تشمل encapsidation الفيروس في الجسم الحي من شأنه أن يوفر المعارف الأساسية لفهم كيفية الفيروسات تتكاثر والتجمع. في الآونة الأخيرة في encapsidation المختبر تم استغلال للبحوث في مجال الطب الحيوي IMAجينج والتطبيقات العلاجية. الفيروسات النباتية غير يلفها يقف متقدما بفارق كبير في هذا المشروع من encapsidation في المختبر من المواد الخارجية السالبة. وقد استخدمت Brome فيروس فسيفساء (BMV)، وهو غير يلفها فيروس RNA متعدد المكونات المسببة للنباتات، ونظام نموذجي لدراسة الجينوم في التعبئة والتغليف والمجراة في المختبر. لفحوصات encapsidation في محطات benthamiana نيكوتيانا، الأجرعية بوساطة التعبير عابرة، تشير إلى مثل agroinfiltration، وهي تقنية فعالة وقوية لتسليم متزامنة والتعبير عن مكونات متعددة إلى نفس الخلية. في هذا النهج، هو تسلل تعليق من الخلايا الأجرعية المورمة الناقلة البلازميد ثنائي تحمل cDNAs من mRNAs desiredviral إلى ورقة الفضاء withina بين الخلايا باستخدام أي شيء أكثر تعقيدا من حقنة القابل للتصرف 1 مل (بدون إبرة). هذه نتائج عملية في نقل إدراج الحمض النووي في الخلايا النباتية، وT-DNAإدراج يبقى عابر في النواة وكتب بعد ذلك من قبل المضيف الثاني بوليميريز، مما يؤدي إلى التعبير عابر. ويتم تصدير ثم نص مرنا الناتج (المغطاة ومذيل بعديد الأدينيلات) إلى السيتوبلازم للترجمة. بعد ما يقرب من 24 إلى 48 ساعة من الحضانة، ويمكن أخذ عينات من أجزاء الأوراق مخترقة للتحاليل الكيميائية الحيوية microscopyor. Agroinfiltration يسمح بأعداد كبيرة (مئات الآلاف) من الخلايا لtransfected في وقت واحد. لفي المختبر encapsidation، virions تنقيته من BMV هي نأت إلى البروتين قفيصة بواسطة dialyzing ضد كلوريد الكالسيوم تفارق العازلة التي تحتوي على تليها إزالة الحمض النووي الريبي وvirions برنامج الأمم المتحدة للفصل عن طريق الطرد المركزي. يتم تجميعها ثم الجينوم مفارز المنضب قفيصة البروتين المطلوب مع مكونات الجينوم الفيروسي أو غير الفيروسية مكونات مثل indocyanine صبغ.
Protocol
Discussion
يمكن مقاربة Agroinfiltration المقدمة هنا يكون على نطاق واسع ينطبق على مجموعة واسعة من الفيروسات النباتية. وتزامن وثمة سمة مميزة لهذا النهج تسليم agroconstruct متعددة إلى خلية واحد في نفس العيب الرئيسي المرتبطة عادة مع التلقيح الميكانيكي تستخدم بشكل روتيني من الفيروسات النباتية. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر العديد من أعضاء مختبر لإبداء اقتراحاتهم القيمة في تطوير agroinfiltration والمقايسات في الجمعية المختبر. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منحة من جامعة كاليفورنيا. وأيد هذه الدراسة في أجزاء من منحة مقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم (CBET-1144237).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MES Sodium salts | Sigma-aldrich | M2993 |
| Indocyanine green | Sigma-aldrich | I2633 |
| Beckman ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model: L8-70M |
| Centricon-100 column | Millipore | YM-100 |
| Spectrophotometer | Cary 50, Varian Inc. | Part number 10068900 |
| Spectrofluorometer | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Part number FL3-21 |
References
- Annamalai, P., Rao, A. L. Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging. Virology. 338, 96-111 (2005).
- Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration. J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).
- Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. . Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).
- Lane, L. C. The bromoviruses. Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).
- Choi, Y. G., Rao, A. L. Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals. Virology. 275, 207-217 (2000).
- Sambrrok, J., Russel, D. W. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).
- Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation. J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).
- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications. A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103, 157-167 (2000).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
