Summary

Isolierung und Kultivierung von Neuronen im Hippocampus von Mäusen Pränatale

Published: July 26, 2012
doi:

Summary

Wir stellen ein Protokoll für die Kultur von hoch gereinigten hippocampalen Neuronen von der pränatalen Mäusehirn ohne die Verwendung eines Abzweiges Gliazellen Schicht.

Abstract

Primäre Kulturen von Ratten-und Mäuse-Neuronen im Hippocampus werden häufig eingesetzt, um zelluläre Mechanismen in der Neurobiologie zu offenbaren. Durch die Isolierung und wachsenden einzelnen Neuronen, sind Forscher in der Lage, Eigenschaften im Zusammenhang mit zellulären Transports, Zellstruktur und individuelle Protein-Lokalisierung mit einer Vielzahl von biochemischen Techniken zu analysieren. Die Ergebnisse solcher Experimente sind entscheidend für die Überprüfung von Theorien Adressierung die neuronalen Grundlagen von Gedächtnis und Lernen. Allerdings sind eindeutige Ergebnisse aus diesen Formen von Experimenten auf die Fähigkeit, neuronale Kulturen mit mindestens Kontamination durch andere Zelltypen Gehirn wachsen prädiziert. In diesem Protokoll, nutzen wir Medien für Neuron Wachstum und vorsichtige Präparation von embryonalen hippocampalen Gewebe ausgebildet ist, um das Wachstum von gesunden Neuronen optimiert werden, kontaminierenden Zelltypen (zB Astrozyten). Embryonale Maus hippokampalen Gewebe kann schwieriger zu isolieren als vergleichbare Nagetier Gewebe aufgrund der Größe der Stichprobe für dissection. Wir zeigen detaillierte Analyse Techniken des Hippocampus aus embryonalen Tag 19 (E19) Maus Welpen. Sobald hippocampalen Gewebe isoliert wird, wird sanft Dissoziation von neuronalen Zellen mit einer verdünnten Konzentration von Trypsin und mechanische Zerreißen zur Trennung von Zellen aus dem Bindegewebe erreicht werden, während nur ein Minimum an Schädigung einzelner Zellen. Eine detaillierte Beschreibung, wie Pipetten vorzubereiten, in der Störung verwendet werden soll, enthalten. Optimale Beschichtung Dichten werden für Immun-Fluoreszenz-Protokolle, um erfolgreich Zellkultur zu maximieren. Das Protokoll ermöglicht einen schnellen (etwa 2 Stunden) und effiziente Technik für die Kultur von neuronalen Zellen aus Maus hippocampalen Gewebe.

Protocol

1. Set-up vor der Ernte Um pränatale Welpen für Neuron Ernte zu erzeugen, planen Zucht zwischen erwachsenen Mäusen 19 Tage vor dem Tag des Neurons Isolation. (C57BL / 6 Mäusen im Alter von 2-8 Monaten wurden in Paarungen für die Zwecke der Entwicklung dieses Protokolls verwendet). Erfolgreiche Paarung durch Nachweis einer vaginalen Stecker kann in der weiblichen, Herzklopfen oder visuelle Bestätigung einer Schwangerschaft bestätigt werden. Der Tag vor dem Neuron Trennung: <ol class="…

Discussion

Hippokampalen Kulturen haben in der Molekularbiologie seit mehr als 20 Jahren verwendet. Während im Prinzip neuronale Kulturen von jedem Teil des Gehirns vorgenommen werden können, haben hippocampalen Kulturen sich als höchst populär aufgrund der relativ einfachen Architektur des Nerven Zellpopulation im Hippocampus 7 sein. Hippokampuskulturen werden typischerweise aus Late-Stage-embryonalem Gewebe gefertigt. Dieses Gewebe ist leichter zu distanzieren und enthält weniger als Gliazellen tut reifen Gehirng…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Michael Wooten für seine Hilfe bei der Erstellung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom NIH 2RO1NS033661 (MWW) unterstützt.

Materials

Name of Reagent Vendor Catalog Number
Rat Tail Collagen 1 BD Biosciences 354236
Poly-D-lysine Solution Chemicon A-003-E
Hanks Balanced Salt Solution Invitrogen 14175-095
Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid Invitrogen 15050-065
NeuroBasal Medium (1X) liquid Invitrogen 21103-049
B27 Supplement (50X) liquid Invitrogen 17504-044
L-Glutamine 200 mM (100X) liquid Invitrogen 25030-149
Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) Invitrogen 15140-148
HI-Donor Horse Serum Atlanta Biologicals S12150H

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Cite This Article
Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. J. Vis. Exp. (65), e3634, doi:10.3791/3634 (2012).

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