Denne videoen protokoll demonstrerer isolasjon og utvidelse av stamceller som celler fra kirurgisk resected human glioblastoma mutliforme (GBM) svulstvev bruker neurosphere analysen kulturen metoden.
Stem-lignende celler har vært isolert i svulster som bryst, lunge, tykktarm, prostata og hjerne. Et kritisk problem i alle disse svulstene, spesielt i glioblastom mutliforme (GBM), er å identifisere og isolere tumor initiere celle befolkning (r) for å undersøke deres rolle i tumordannelse, progresjon, og gjentakelse. Forstå tumor initiere celle populasjoner vil gi ledetråder for å finne effektive terapeutiske tilnærminger for disse svulstene. Den neurosphere analysen (NSA) på grunn av sin enkelhet og reproduserbarhet har vært brukt som metode for valg for isolasjon og spredning av mange av denne kreftceller. Denne protokollen demonstrerer neurosphere kultur metoden for å isolere og utvide stilk-lignende celler i kirurgisk resected human GBM svulstvev. Prosedyrene har en innledende kjemisk fordøyelsen og mekanisk dissosiasjon av svulstvev, og senere plating den resulterende eneste celle suspensjon i NSA kultur. Etter 7-10 dager, primære neurospheres av 150-200 mikrometer i diameter kan observeres og er klar for videre passaging og ekspansjon.
Å isolere nevrale stamceller og stamceller fra normal voksen og fosterets hjerne 1, 2, 3, 4 og også tumor stilk-lignende celler fra cancer vev som fem lunge-, prostata-6, bryst 7 og 8 hjerne, 9 den neurosphere analysen har vært hyppig brukt som metode for valg. Ved hjelp av denne enkle og reproduserbare analysen, kan man generere et ubestemt antall celler fra resected svulstvev som viser lignende egenskaper som somatiske stamceller; ex vivo multipotency, evnen til å skape nye svulster etter implantasjon, og selvfornyelse. Disse cellene kan brukes til å studere grunnleggende kreft cellebiologi inkludert celle-til-celle interaksjoner, og differensiering, migrasjon, invasjon og celledød. I tillegg isolerte tumor stilk-lignende celler gir et uvurderlig verktøy for å studere hvordan svulster form, fremdrift, og tilbakefall og også å avdekke de underliggende deriving cellulære mekanismene som til slutt kunne gi innsikt til terapeutiskalternativer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Florida Centre for hjernesvulst forskning; Preston A. Wells Jr Center for Brain Tumor Therapy.
Name of the reagent | Type | Company | Catalogue number | Comments |
NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
%0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
*MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
*HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
*Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
**DNase I | Reagent | Roche | 104159 | |
**Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD | 371610 | |
Petri Dish | Culture ware | BD Falcon | 353003 | |
Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.