Summary

Расширение цитотоксических Т-лимфоцитов из пуповинной крови, что целевая цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр Вирус, и аденовирус

Published: May 07, 2012
doi:

Summary

Здесь мы опишем первый надлежащей производственной практики (GMP)-совместимый способ получения вирус-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) из пуповинной крови, источником преимущественно наивных Т-клеток.

Abstract

Вирус инфекции после трансплантации стволовых клеток являются одними из самых распространенных причин смерти, особенно после пуповинной крови (CB) Трансплантация (CBT), где ЦБ не содержит заметное количество вируса опытный Т-клеток, который может защитить получателя от инфекции 1. – 4 Мы и другие показали, что вирус-специфических CTL, полученные от инфицированных доноров и настаивают, чтобы получатель являются безопасными и защитные. 5-8 Однако, до недавнего времени вирус-специфических Т-клеток, не могли быть получены из пуповинной крови, вероятно, связано с Отсутствие вирус-специфических Т-клеток памяти.

В попытке лучше имитировать в естественных условиях грунтовки наивных Т-клеток, мы создали метод, который использовал CB-дендритных клеток (ДК) трансдуцированных аденовирусные вектора (Ad5f35pp65), содержащих антиген CMV иммунодоминантные РР65, следовательно, вождение Т клеточную специфичность к ЦМВ и аденовирус. 9 На инициацию, мы используем эти мазахваченного ДК, а также CB-производных Т-клеток в присутствии цитокинов IL-7, IL-12 и IL-15. 10 На второй стимуляции мы использовали EBV-трансформированных клеток, или EBV-LCL, которые выражают как скрытых и литические антигены ВЭБ. Ad5f35pp65-трансдуцированных EBV-LCL используются для стимуляции Т-клеток в присутствии ИЛ-15 на второй стимуляции. После стимуляции использовать Ad5f35pp65-трансдуцированных EBV-LCL и ИЛ-2.

Из 50×10 6 CB мононуклеаров мы способны генерировать свыше 150 х 10 6 вирус-специфических Т-клеток, что лизировать антиген-импульсной цели и освобождение цитокинов в ответ на антигенную стимуляцию 11. Эти клетки были изготовлены в GMP-совместимый способом, используя только 20% доля фракционированного блок пуповинной крови и были переведены для клинического использования.

Protocol

1. Мононуклеарные изолятор (день 0) Вставьте всплеск женской Luer адаптер к розетке порта 20% долей единицы пуповинной крови, приложить шприц и удалить кровь. Передача талой крови до 20 мл RPMI нагревают в 50 мл центрифужные пробирки. Промойте мешок пуповинной крови с 5 мл RPMI и трансфер в то?…

Discussion

Данной стратегии, направленные на борьбу с вирусными инфекциями после ТОС могут быть эффективными, но они связаны со значительными токсичности, стоят дорого, и не придают долгосрочную защиту против инфекции позже. На самом деле, использование некоторых противовирусных препаратов ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Dan Duncan L. совместных исследовательских грантов (CMB и EJS), Национальный институт сердца, легких и крови институт (US4HL081007), лейкемии и лимфомы общества клинической награду научный сотрудник (CMB) и Национального института рака (RO1 CA06150816; EJS).

Materials

Name of reagent Company Catalogue number
RPMI 1640 Invitrogen 21870-076
DC media CellGenix 20801-0500
EHAA (Click’s Medium) Irvine Scientific 9195
Human Serum Gemini Bio Products 100-110
Gas Permeable Cultureware18 Wilson-Wolf 80040S
IL-2 Chiron (TCH Pharmacy)  
IL-12 NCI/CTEP  
IL-15 CellGenix 1013-050
IL-7 R&D AFL207
IL-1beta R&D AFL201
IL-6 CellGenix 1004-050
GM-CSF TCH Pharmacy  
IL-4 R&D AFL204
TNF-alpha R&D AFL210
Ad5f35pp65 BCM CAGT Vector Production Facility  
Plasma transfer set with female luer adapter Charter Medical 89-550-66j
Lymphoprep Nycomed 1114550

References

  1. Kennedy-Nasser, A. A. Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1245-1245 (2008).
  2. Hanley, P. J. Improving clinical outcomes using adoptively transferred immune cells from umbilical cord blood. Cytotherapy. 12, 713 (2010).
  3. Szabolcs, P., Cairo, M. S. Unrelated umbilical cord blood transplantation and immune reconstitution. Semin. Hematol. 47, 22 (2010).
  4. Canto, E., Rodriguez-Sanchez, J. L., Vidal, S. Distinctive response of naive lymphocytes from cord blood to primary activation via TCR. J. Leukoc. Biol. 74, 998-998 (2003).
  5. Leen, A. M. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat. Med. 12, 1160-1160 (2006).
  6. Riddell, S. R. Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones. Science. 257, 238 (1992).
  7. O’Reilly, R. J. Adoptive transfer of antigen-specific T-cells of donor type for immunotherapy of viral infections following allogeneic hematopoietic cell transplants. Immunol. Res. 38, 237-237 (2007).
  8. Peggs, K. S. Adoptive cellular therapy for early cytomegalovirus infection after allogeneic stem-cell transplantation with virus-specific T-cell lines. Lancet. 362, 1375-1375 (2003).
  9. Sili, U. Large-scale expansion of dendritic cell-primed polyclonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cell lines for adoptive immunotherapy. J. Immunother. 26, 241 (2003).
  10. Bollard, C. M. Good manufacturing practice-grade cytotoxic T lymphocytes specific for latent membrane proteins (LMP)-1 and LMP2 for patients with Epstein-Barr virus-associated lymphoma. Cytotherapy. 13, 518 (2011).
  11. Hanley, P. J. Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes. Blood. 114, 1958 (1958).
  12. Hanley, P. J. Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation. Cytotherapy. , (2011).
  13. Gerdemann, U. Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant. J. Vis. Exp. (51), e2736 (2011).
  14. Mori, T., Kato, J. Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem cell transplantation. Int. J. Hematol. 91, 588 (2010).
  15. Einsele, H. Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood. 99, 3916 (2002).
  16. Bao, L. Expansion of cytomegalovirus pp65 and IE-1 specific cytotoxic T lymphocytes for cytomegalovirus-specific immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1156 (2008).
  17. Shpall, E. J., Bollard, C. M., Brunstein, C. Novel cord blood transplant therapies. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, S39-S45 (2011).
  18. Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex. J. Immunother. 33, 305 (2010).

Play Video

Cite This Article
Hanley, P. J., Lam, S., Shpall, E. J., Bollard, C. M. Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus. J. Vis. Exp. (63), e3627, doi:10.3791/3627 (2012).

View Video