Hele Animal Perfusie Fixatie voor knaagdieren

1. Bereid Fixatief (Zie tabel Fixatief en buffers.) 2. Bereid Perfusie Buffers (Zie tabel Fixatief en buffers.) 3. Bereid Apparaten en Anesthesie Met behulp van het waterbad, warme perfusie buffer tot 37 ° C. Plaats uitlaatklep in een bekerglas gevuld met buffer. Vul een 50 ml spuit met buffer en hechten aan fixeermiddel buizen. Herhaaldelijk Spoel slang door verdrijven of intrekking van de buffer. Maak de lijn met buffer totdat alle luchtbellen in de slang worden geëlimineerd. Het is cruciaal voor het succes van een perfusie niet om luchtbellen te hebben in een van de lijnen. Verwijder de spuit en sluit de 4% paraformaldehyde fixatief (kamertemperatuur) container. Om luchtbellen in de slang einde te vermijden, knijp de buis, terwijl het plaatsen van de buis in de container zodat er een druppel buffer steekt vanaf het einde to contact opnemen met de vloeistof oppervlak in de container. Sluit de uitlaatpoort (naald einde). Draai buffer afsluiter (blauw) om dezelfde positie als het fixeermiddel klep (wit). Hierdoor kunnen vloeien voort uit de buffer lijn alleen. Open de uitlaatpoort en herhaal stap A1 tot en met A3 voor het vullen van de buffer lijn. Nadat alle luchtbellen dicht geëlimineerd de uitlaatpoort, verwijder de spuit en sluit de buffer container, waarbij zorg niet om luchtbellen te introduceren in de slang. Test systeem voor het vermogen om onder druk te houden door het pompen van het rubber manometer blub. Er is doorgaans enige weerstand vanwege de compressie van de lucht in het systeem. Stel een operatie tools om voor eenvoudige toegang. Vul perfusie naald met buffer de mogelijkheid luchtbellen te verwijderen. Voorafgaand aan chirurgie, wordt een ketamine / xylazine mengsel (tot 80 mg / kg lichaamsgewicht ketamine en 10 mg / kg lichaamsgewicht xylazine) toegediend intraperitoneale injectie (27 gauge naald en 1 cc spuit). Extra toediening verdoving wordt uitgevoerd als nodig tijdens elke bewerking een chirurgische vlak van anesthesie handhaven. 4. Perfusie Chirurgie Als het dier eenmaal heeft bereikt een chirurgische vlak van anesthesie, plaats het op de ondiepe bak gevuld met crushed ijs. (Gebruik teen pinch-reactie methode om de diepte van anesthesie te bepalen. Dieren moeten niet reageren voordat u verder gaat). Maak een 5-6 cm laterale incisie door de omhulling en buikwand net onder de ribbenkast. Haal voorzichtig de lever van het middenrif. Maak een kleine incisie in het membraan met behulp van de gebogen, stompe schaar. De positie en de druk van de vinger kan helpen bij het vermogen om het membraan te snijden. Verdere membraan incisie langs de gehele lengte van de ribbenkast van de pleura-holte bloot te leggen. Plaats gebogen, stompe schaar langs een zijde van de ribben zorgvuldig verplaatsen van de longen en een cut door de ribbenkast tot aan het sleutelbeen. Maak een vergelijkbare snee in de contralaterale zijde. Het opheffen van de borstbeen weg, knip zorgvuldig elk weefsel aan te sluiten op het hart. Klem de punt van het borstbeen met de hemostat en plaats de hemostaat over het hoofd. Wanneer goed uitgevoerd, de thymus tilt uit de buurt van het hart, samen met het borstbeen, die een duidelijk beeld van de grote schepen. Maak een kleine incisie aan de achterste eind van de linker ventrikel met behulp van iris schaar. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Laat een 15-gauge bot-of olijf-tip perfusie naald door de snede hartkamer in de aorta ascendens. De tip moet zichtbaar zijn door de wand van de aorta, en mag niet bij de aortaboog waar de arm en de halsslagaders uiteen. Gebruik een hemostaat naar het hart vast te klemmen, dit stelt de naald en voorkomt lekkage. Desgewenst kan de gemodificeerde hemostat worden gebruikt om de aorta klemmen rond de naald (deze hemostats blijven totdat ontleding begint, maar weggelaten toekomstige illustraties voor de duidelijkheid). Tot slot maken een incisie het recht van het dier atrium met iris een schaar om zo groot op een stopcontact mogelijk te maken zonder beschadiging van de dalende aorta. Op dit punt is het dier klaar om te worden doorbloed is. 5. Perfusie Open en sluit uitlaatpoort om de naald basis zorg ervoor dat u eventuele luchtbellen te introduceren. Pomp de manometer lamp een druk van 80 mm Hg snel en gelijkmatig. Houd deze druk in de buffer infusie periode. Start de timer. Pas de naald hoek. De hoek van de naald is cruciaal voor het bereiken van een maximaal debiet (let op de stroom veranderen met instelbare hoek). Schakel de buffre afsluiter (blauw) als buffer is bijna klaar (200 ml). De vloeistof moet worden uitgevoerd duidelijk. De verrekening van de lever is een indicator van een goede doorbloeding. De lever moet duidelijk zijn op dit punt. Geef de tijd voor uw administratie. Fixatie bevingen in acht worden genomen binnen een paar seconden: dit moet worden beschouwd als de ware tijd van fixatie. Geef de tijd voor uw administratie. De druk kan geleidelijk te verhogen tot maximaal 130 mm Hg 2 een constante stroom te behouden. Sluit de uitlaatklep zodra de fixatief is bijna klaar. Geef eindtijd voor uw administratie. De rat moet stijf zijn in dit stadium. De gebruikte paraformaldehyde moet worden verzameld en opgeslagen voor verwijdering volgens de voorschriften van uw instelling. 6. Dissection 4,11 Verwijder de kop met een schaar. Maak een middellijn incisie langs de integument van de nek naar de neus en blootschedel. Snij de resterende nekspier, zodat de basis van de schedel wordt blootgesteld, verwijder eventueel resterende spieren met behulp van schaar of rongeurs. Plaats het scherpe uiteinde van een paar iris schaar in de foramen magnum enerzijds goed glijdende de schaar langs het binnenoppervlak van de schedel. Maak vervolgens een snede uit te breiden tot de verste rand van de achterste schedel oppervlak. Maak een identieke snee in de contralaterale zijde. Gebruik de rongeurs op te ruimen de schedel rond de kleine hersenen. Schuif de schaar langs het binnenoppervlak van de schedel de tip loopt van de dorsale distale achterste hoek van de distale frontale rand van de schedel, op te tillen het mes u snijden van hersenbeschadiging voorkomen. Herhaal aan de andere kant. Met behulp van rongeurs schil de dorsale zijde van de schedel uit de buurt van de hersenen. Snij de zijkanten van de schedel met rongeurs ook. Met behulp van een spatel, verbreken de olfactorische bollen en nerveus aansluitinggen langs het ventrale oppervlak van de hersenen. Voorzichtig te plagen de hersenen uit de buurt van het hoofd, trimmen elke dura die nog steeds de hersenen verbindt met de schedel met behulp van iris schaar. Verwijder de hersenen en plaats het in een flesje fixatief bevattende vloeistof minstens 10x het volume van de hersenen zelf. Zwenk de flacon af en toe. 7. Post-fixatie & Opslag Houd de hersenen in fixeermiddel voor 24 uur bij 4 ° C, wervelende af en toe. Na 24 uur was de hersenen met fosfaat gebufferde zoutoplossing door uitwisseling van het medium 3 keer en wervelende telkens. Hersenen kan vervolgens worden opgeslagen in fosfaat gebufferde zoutoplossing of HBHS met natriumazide en bewaard bij 4 ° C. 8. Representatieve resultaten Een eerste indicator van het succes van de perfusie is de clearing van de extremiteiten, zoals de neus, oren en poten en interne organen zoals de thymus en de lever (IHC World).Bruto inspectie van de hersenen toont het bloedvat leegte van bloed (wit tot lichtgeel uiterlijk). Dit zal ook het geval in weefselcoupes bestemmen voor de kleuring en immunohistochemie. De laatste indicator van het resultaat van de perfusie is de toestand van de ultrastructuur in het weefsel. 1,6,7,8 Bereid Fixatief: Bereid 8% paraformaldehyde voorraad Voeg 40 g paraformaldehyde tot 500 ml dH 2 O. Verwarm de oplossing tot 60 – 65 ° C onder roeren (niet meer dan 65 ° C, dit kan afbreuk het succes van de immunohistochemische procedure). Om de oplossing te verwijderen, zet het vuur lager en voeg 2-3 ml van 1,0 M NaOH met een druppelaar. Filter en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand. Bereid 0,2 M natriumfosfaat buffer, pH 7,4 Voor de monobasisch voorraad, voeg 27,8 g NaH 2 PO 4 * H 2 O tot en met 1 L dH 2 O. Voor de dibasisch voorraad, voeg 28,4 g Na 2 HPO 4 tot 1 liter dH 2 O. Voeg 810 ml van de monobasisch voorraad tot 190 ml van de dibasisch voorraad. Bereid 4% paraformaldehyde Fixatief Voeg gelijke delen 8% paraformaldehyde in voorraad hebben voor 0,2 M natriumfosfaatbuffer Opmerking: deze correctie wordt het best vers bereid, niet meer dan 72 uur van tevoren. Bereid Perfusie en opslag Buffers: Bereid fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing, pH 7,4 1 L dH 2 O 9 g NaCl 144 mg KH 2 PO <sub> 4 795 mg Na 2 HPO 4 Controleer de pH HEPES gebufferde Hanks Solution (HBHS) met natriumazide pH 7,4 990 ml dH 2 O 7,5 g NaCl, 0,3 g KCl 0,06 g KH 2 PO 4 0,13 g Na 2 HPO 4 2 g Dextrose / glucose 2,4 g 10 mm Hepes 0,1 g MgCl2 6 delen dH 2 O 0,05 g MgSO 4 7 delen dH 2 O 0,165 g CaCl 2 2 delen dH 2 O 90 mg NaN3 Controleer de pH Tabel 1. Voorbereiding van Fixatief en buffers. Figuur 1. </strong> Perfusie met gelabelde Inrichting componenten. Figuur 2. Voorbereiding van de perfusie Apparatuur I. Begin met het fixeermiddel lijn. Spoel de slang van luchtbellen en vul met buffer door snel verdrijven of intrekking van de buffer in de spuit en door de lijn. Sluit de afsluiter op de naald einde uit. Plaats de fixatief lijn in het fixeermiddel fles zonder dat er luchtbellen. Figuur 3. Voorbereiding van de perfusie Apparatuur II. 1. Open klep op de naald eind. 2. Draai buffer afsluiter (blauw) in de stand voor flow. 3. Spoel de slang van luchtbellen en vul met buffer door snel verdrijven of intrekking van de buffer met de spuit. 4. Sluit klep op de naald eind. Plaats slang in de buffer fles. Test de druk om te controleren of het systeem correct verzegeldly door het oppompen van de manometer lamp en het kijken naar de meter. Het apparaat is nu klaar voor de perfusie procedure. Figuur 4. Perfusie Apparatuur positie voor buffer levering. Figuur 5. Perfusie Chirurgie I. a) Maak een laterale incisie door de omhulling en buikwand. b) Maak een insnijding in het middenrif en dwars door het membraan het blootstellen van het hart. Merk evenwijdige sneden aan weerszijden van de ribben aan het sleutelbeen. c) klem de punt van het borstbeen met de hemostat en plaats de hemostaat over het hoofd. Figuur 6. Perfusie Chirurgie II. a) Voer de perfusie naald door de snede hartkamer in de aorta ascendens. b) Bevestig deperfusie naald gebruik een set hemostats naar het hart vast te klemmen. Een tweede set van gewijzigde hemostaat kan ook worden gebruikt om de aorta klemmen rond de naaldpunt te voorkomen lekkage. Met behulp van iris schaar een kleine incisie aan het achterste eind van de linker hartkamer. Figuur 7. Perfusie met Buffer Pomp de manometer lamp om de druk in de regel te maken. Open de klep (1) en bevestig deze aan de naald hub. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd. Pomp de manometer lamp een druk van 80 mm Hg en houden deze druk gedurende de buffer infusie. Figuur 8. Perfusie met een fixatief Als buffer is bijna klaar (200 ml) schakelt de buffer ventiel (1), zodat voor het fixeermiddel te stromen. De druk kan geleidelijk worden verhoogd tot eenmaximaal 130 mm Hg. Figuur 9. Dissection I. a) verwijderen van de kop met een paar schaar. b) maakt een sneetje in de huid langs de middellijn van de nek naar de neus en bloot de schedel. c) gekozen uit de resterende nekspier zodat de basis van de schedel blootgesteld. Houd het hoofd, zodat de grote opening in de schedel oppervlak (foramen magnum) toegankelijk is. Steek de scherpe punt van een paar van iris schaar in het foramen magnum en maak een snede. Herhaal deze manoeuvre voor de contralaterale zijde. Gebruik de rongeurs op te ruimen de schedel rond de kleine hersenen. Figuur 10. Dissection II. a) de schuif schaar langs het binnenoppervlak van de schedel. Til op de punt als u snijden om schade aan de hersenen te voorkomen. Herhaal hetzelfde voorandere kant. Weg Gebruik rongeurs schil de schedel van de hersenen. b) illustratie met de schedel verwijderd en de hersenen blootgesteld. c) het gebruik een spatel om de olfactorische bollen en zenuwverbindingen te verbreken op de meest voorste locatie van de hersenen. Leid de spatel te breken langs de onderkant van de hersenen om verbindingen te verbreken voor het gemak van verwijderen. Verwijder de hersenen en plaats het in een flesje fixatief.