Transretinal Recordings ERG di retina di topo: Rod e fotorisposte Cone
Summary
Descriviamo un metodo relativamente semplice di transretinal elettroretinogramma (ERG) per l'ottenimento di registrazioni fotorisposte asta e cono da retina di topo intatto. Questo approccio sfrutta il blocco della trasmissione sinaptica da fotorecettori per isolare le loro risposte chiare e registrarli usando elettrodi posizionati sul campo in tutto il isolato piatto montato retina.
Abstract
Ci sono due classi distinte di formazione di immagini fotorecettori della retina dei vertebrati: bastoncelli e coni. I bastoncelli sono in grado di rilevare singoli fotoni di luce, mentre i coni operano continuamente sotto rapida evoluzione delle condizioni di luce intensa. L'assorbimento della luce da parte di asta-e pigmenti visivi cono-specifiche nei segmenti esterni dei fotorecettori fototrasduzione innesca una cascata che porta alla chiusura dei ciclici nucleotide-gated canali sulla membrana plasmatica delle cellule e la iperpolarizzazione. Questa luce cambiamento indotto nella membrana attuale e potenziale può essere registrato come fotorisposta, da una classica tecnica di aspirazione 1,2 elettrodo di registrazione o da registrazioni elettroretinografico transretinal (ERG) da retine isolate con farmacologicamente bloccate componenti risposta postsinaptica 3-5. Quest'ultimo metodo consente di droga accessibili a lunga durata delle registrazioni da fotorecettori del mouse ed è particolarmente utile per ottenere fotorisposte stabili from i coni del mouse scarse e fragile. In caso di coni, tali esperimenti possono essere eseguiti sia in condizioni di buio adeguate e seguenti illuminazione intensa che candeggianti essenzialmente il pigmento visivo, per monitorare il processo di recupero cono fotosensibilità durante l'adattamento al buio 6,7. In questo video, ci mostrerà come eseguire le registrazioni transretinal asta e M / L-cone-driven da dark-adattato retina mouse. Registrazioni stelo sarà effettuata utilizzando retina di tipo selvatico (C57BL / 6) topi. Per semplicità, cono le registrazioni saranno ottenute da organismi geneticamente modificati asta transducina α-subunità knockout (Tα – / -) topi che mancano di asta di segnalazione 8.
Protocol
Discussion
Il metodo di asta-e cono-driven transretinal registrazioni ERG sopra descritto sta diventando un potente strumento per studiare la funzione dei fotorecettori del mouse sia nel tipo selvatico e animali geneticamente modificati. Oltre alla caratterizzazione delle proprietà di facile fotorisposta base, questa semplice tecnica fornisce una grande stabilità durante risposta durature esperimenti condotti su prossima al intatte preparati retina. Sia adattato al buio dell'ampiezza della risposta massima asta fotosensibili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supportato da Career Development Award dalla ricerca per prevenire la cecità, le sovvenzioni NIH EY19312 e EY19543 (VJK), così come da sovvenzione illimitata di ricerca per la Prevenzione della Cecità e EY02687 (Dipartimento di Oftalmologia e Scienze visiva presso la Washington University).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| DL-AP-4 | TOCRIS bioscience | 0101 | ||
| All other reagents | Sigma-Aldrich | |||
| Glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | For making electrodes | |
| Filter paper | HARG | Millipore | HABG01300 | |
| Photometer | UDT Instruments | S350 | For light calibration | |
| Radiometric silicon sensor | UDT Instruments | 221 | For light calibration | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corporation | TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 | To minimize mechanical noise | |
| Air compressor Panther P 15TC | Werther International | P 15TC | Connected to anti-vibration table | |
| Stereomicroscope | LEICA | MZ9.5 | For mouse eye dissection | |
| Infrared image converters | B.E.Meyers | ProwlerTM | Bound to stereomicroscope | |
| Differential amplifier DP-311 |
Warner Instruments | DP-311 | ||
| Axon Digidata 1440A Digitizer | Molecular Devices | 1440A | ||
| Dual Channel 8-pole Filter | KROHN-HITE Corporation | 3382 | ||
| Ceramic resistor | TE Connectivity | CGS SBCHE618RJ | For reheating the perfusion solution | |
| Thermocouple | T | Physitemp Instruments | IT-18 | |
| Temperature monitor | Omega | DPi32 | Connected to thermocouple | |
| LED 505 nm | TT Electronics/ Optek Technology | Digi-key P/N 365-1185-ND | To apply test flashes/bleaching light | |
| Cautery pen | Bovie | AA25 | For marking the dorsal part of the mouse eyeball | |
| pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices |
References
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