Monitoreo escinde actividad caspasa-3 y la apoptosis de las células inmortalizadas oligodendrogliales utilizando células vivas, imágenes y Cleaveable Sustratos Fluorogenic-dye Después de despolarización de la membrana de potasio inducida por

1. La descongelación y el cultivo de células Obtener un balance de congelados inmortalizado N19-oligodendroglial células de largo plazo, las tiendas de nitrógeno líquido. Sumerja vial que contiene las células a 37 ° C baño de agua hasta que la suspensión de células esté completamente descongelado. 7 ml de DMEM (Dulbecco Modificado Medio de Eagle) con alta glucosa suplementado con 10% de SFB (suero fetal bovino) y 1% de penicilina / estreptomicina a una placa de 10 cm de la cultura. Añadir la célula de suspensión, gota a gota a la placa, y agitar suavemente y el rock de la placa de Petri para dispersar las células de manera uniforme. Las células de cultivo a 34 ° C / 5% CO 2 incubadora. Después de 4 horas, los medios de comunicación aspirado de las placas para eliminar cualquier resto de DMSO (dimetilsulfóxido), que había sido utilizado como un crioprotector, y reemplazar con medio fresco (7 ml DMEM alto de glucosa en medios suplementados con 10% de SFB y 1% de penicilina / estreptomicina) . 2. Las células pases En un 70-80%confluencia (4-7 días de crecimiento), aspirar los medios de comunicación de las células. Añadir 1 ml de tripsina al 0,25% a la placa. Pipeta la tripsina para separar las células (aproximadamente 5 minutos). Realizar las diluciones adecuadas para las condiciones experimentales y el paso de un adicional de 10 cm de la placa para futuros experimentos a una densidad celular no menos de 0,1 x 10 6 células / ml. Nota: Es necesario el paso a las células por lo menos dos veces después de la descongelación antes de usarlos para experimentos. 3. Contar y Revestimiento células A las células de la placa de células vivas, imágenes, trypsinize como se describió anteriormente. Quite aproximadamente 30 l de las células y el recuento con un hemocitómetro. Coloque un cubreobjetos de vidrio sin recubrimiento en una placa de 6 pocillos. Agregar celdas a la pocillos a una densidad de 0,1 x 10 6 células / ml en 2 ml de fenol libre de DMEM alto de glucosa en los medios de comunicación, suplementado con FBS al 10% y el 1% de penicilina / estreptomicina, a los 34 ° C / 5% CO 2. Permitirlas células a crecer durante la noche (16-20 h) a 34 ° C / 5% de CO 2 antes de la transfección. 4. Transfección Combine 100 l medio libre de suero, 0.5-4 mg purificada ADN plásmido, y 4 l HD FuGENE (Roche). Vortex suavemente para mezclar. Vortex de nuevo brevemente y permitir que el ADN al complejo por 5 min a temperatura ambiente, y luego añadir FuGENE mezcla de ADN de alta definición directamente en las células cultivadas. Incline la placa suavemente para mezclar. Cultivar las células durante 48 horas a 34 ° C / 5% de CO 2 antes del tratamiento o la experimentación. 5. Las células para la preparación de imágenes de células vivas (LCI) Encienda el LCI Chamlide células vivas, caja de control de instrumentos por lo menos 1 hora antes de que desea iniciar el experimento. La caja de control regula la temperatura y la humedad dentro de la Chamlide LCI, y regula el flujo de la premezcla 5% de CO 2. Nota: Es aconsejablea su vez en la caja de control de hasta 3 horas antes del comienzo experimentos para asegurarse de que toda la etapa alcanza 34 ° C. Este paso será reducir la deriva de coordinación, que es causada por fluxulation y la expansión térmica de la fase de metal que se calienta, durante la exploración. Trabajar en una campana de flujo, rocíe el Chamlide de tipo magnético cámara de cultivo, y las pinzas, con el 70% de etanol y dejar que se sequen durante 5 minutos. Eliminar las células de la incubadora y confirmar que están sanos. Deben aparecer adherente y bien extendidas sobre el portaobjetos de vidrio con numerosos procesos de membrana. Las células que se destacó de la transfección no son adecuados para la experimentación, y tendrán una reducción del número de extensiones de proceso, y con frecuencia tienen un núcleo de forma irregular. La inclinación de la placa de 6 pocillos y retirar el cubreobjetos con unas pinzas. Rápidamente coloque el lado de células cubreobjetos hasta en la placa inferior de la cámara de cultivo. No permita que el cubreobjetos se sequen. Conecte el magnético principalcuerpo de la cámara de cultivo y añadir 500 l de los medios de comunicación a partir de los 6 originales y placa en la parte superior del cubreobjetos. Re-utilizando este medio para disminuir la cantidad de tensión puesta en las células causados ​​por cambios ambientales, y también puede ser útil para la evaluación de factores secretados extracelular. Coloque la tapa de cristal en la cámara de cultivo. Use un KIMWIPE rociado con etanol al 70% para eliminar cualquier material residual de la parte inferior del cubreobjetos, que podría interferir con el microscopio. Coloque la cámara de cultivo en los 34 ° C / 5% incubadora de CO 2 durante 30 minutos. Este paso se asegurará de que la propia cámara se calienta a 34 ° C para reducir el desplazamiento del cubreobjetos ya que el metal se calienta. 6. Configuración del microscopio Las imágenes fueron adquiridas aquí usando un microscopio Leica DMIRE2 invertida con una lente de relé de la costumbre y de emisión de la vivienda rueda de filtros de cartucho de carga de ruedas múltiples (Quorum Technologies Inc., Guelph, ON). Campo claro – de luz en 2,5 V y el tiempo de exposición a 240 ms. Proteína fluorescente roja (RFP) – Ganancia fijado en 140 por 200 ms. La proteína verde fluorescente (GFP) – Ganancia fijado en 140 por 500 ms. Nuestro microscopio tiene una lámpara regulable en lugar de un disco giratorio para controlar la cantidad de luz disponible para las células. Realizamos nuestros experimentos con la luz en un 90% de la intensidad máxima de la lámpara. 7. El tratamiento de células con inductores de apoptosis y NucView 488 sustrato de la caspasa-3 Es importante preparar grandes cantidades de inductores de la apoptosis antes de tiempo y congelar en alícuotas, de modo que las concentraciones serán consistentes entre los experimentos. El NucView 488 sustrato es sensible a la luz. Preparar alícuotas de 15 l para reducir los tubos de congelación / descongelación, y guardar a -20 ° C cubierto con papel de aluminio. Trabajo con la iluminación ambiental de la sala lo más bajo posible para reducir la exposición de la NucVea 488 de sustrato a la luz, antes de su uso. Recuperar la cámara de cultivo rápido de la incubadora para que las células no están expuestos a una reducción de la temperatura. Coloque la cámara de cultivo en la cámara ambiental del microscopio, y el uso de pinzas para mantener la cámara de cultivo que se mueva. En este punto también debe atenuar las luces de la habitación. Encienda el 5% premezcla cilindro de CO 2 con regulador dual. Usando el objetivo de 10x, enfoque para encontrar células en el monitor de la computadora usando el microscopio de campo brillante. Nota: usted desea utilizar la mayor apertura numérica del objetivo con la ampliación deseada para reducir el tiempo de exposición. Ofrecer inductores de la apoptosis de las células (en nuestro caso, potasio 80 mM o 100 mM de glutamato), uno de los siguientes métodos se pueden utilizar. Vamos a recurrir a la entrega de potasio 80 mM como un ejemplo, utilizando KCl disuelto como un concentrado de 10 veces en nuestros medios de comunicación la cultura típica. Medios de intercambio by lenta y locales de perfusión: – Use una bomba peristáltica a los medios de cambio en la cámara de cultivo con nuevos medios de comunicación que contiene 80 mM de potasio. – Uno de los extremos de la tubería ofrecerá 10 ml de un stock de 80 mM de potasio disuelto en fenol libre de DMEM, y el otro extremo de la tubería se extraiga material de la cámara. – Usted quiere que por lo menos un cambio 10 veces de los medios de comunicación para asegurar que los medios de comunicación quedan en la cámara tiene la concentración correcta de potasio. – Después de los medios de comunicación se intercambia, añadir 3 l de 488 NucView sustrato a los medios de comunicación en la cámara. Pipeta para mezclar. Adición directa de 80 mM de K + y 488 NucView sustrato a los medios de comunicación en la cámara de la cultura: – Preparar una solución madre 10 veces más de potasio 80 mM disuelto en fenol libre de DMEM. – Añadir 3 l de 488 NucView sustrato a 50 l de potasio 10x 80 mm. Pipeta para mezclar. Añadir a 500 l de fenol-DMEM libre en cámara de cultivo. Nota: este método espreferible si usted está interesado en el mantenimiento o la evaluación del crecimiento u otros factores secretados que pueden estar presentes en los medios de comunicación original. Hemos encontrado que el 488 NucView sustrato es estable en el cultivo de células para los experimentos que dura hasta 36 h. 8. Imágenes de células vivas Haga clic en el canal rojo para mostrar las células transfectadas. Seleccionar y guardar alrededor de una docena de cuadros donde hay varias células transfectadas, y guardar estos "puntos XY etapa". Dependiendo de la cantidad de memoria del ordenador, es posible que se limita al número de puntos de la etapa que va a ser capaz de adquirir. Tienen las imágenes de la captura de microscopio (en campo claro, canal rojo y canal verde) en estas etapas guardan puntos cada 6 minutos. Alguna mancha verde que es visible durante las primeras etapas de los experimentos de probabilidades indica que las células que ya están sometidas a la apoptosis, por lo general para la transfección y / o el estrés ambiental. Apoptosis, debido a los tratamientos experimentales se detectó en un punto de tiempo después del experimento. 9. Análisis estadístico Para cada experimento, se programa el microscopio para adquirir varios puntos de XY para reunir un gran conjunto de datos de manera eficiente. Cada experimento se realiza por duplicado o triplicado, y compilar los datos de distintos experimentos realizados en días diferentes. Cada conjunto de datos, se analizan hasta 15 campos de ver y comparar la relación de la caspasa-negativos células de la caspasa-células positivas (número total de células en el campo de visión / número total de la caspasa-células positivas). Las medidas registradas por cada conjunto de datos se agrupan en un conjunto de muestras más grandes, y se comparan entre sí mediante una tabla de ANOVA (p = 0,05). Se muestran los errores estándar de la media (SEM) de cada experimento, y luego comparar la diferencia de medias mediante la realización de una prueba de comparación de los medios de Tukey (p = 0,05) para determinar quICH tratamientos son muy diferentes unos de otros. 10. Resultados representante Hemos descrito un experimento para ilustrar cómo el NucView 488 sustrato puede indicar una mayor tasa de apoptosis de N19-OLG cultivos celulares siguiendo un tratamiento con una concentración alta de potasio extracelular. El N19-células fueron transfectadas con PP, y fueron tratados con 3 l NucView 488 substrato (control), o 3 l de sustrato NucView 488 y 80 mm [K +] (tratamiento). Las células fueron controlados y las imágenes fueron adquiridas en un curso de 12 h, lo cual es adecuado para los estudios con insultos neurológicos (Figura 1A). En las condiciones de control, no observamos una cantidad significativa de apoptosis en comparación con el 80 mM [K +] cultivos tratados (cuadro hash), que mostró aproximadamente 45% la muerte celular después de 12 h (fig. 1B). La luz verde de fondo observard en las condiciones de control indica que las células que se someten a la apoptosis, sin la adición de potasio extracelular. Prácticamente ninguna de las células de la apoptosis de control de exhibición experimento por el punto de tiempo de 12 h, aunque en otras situaciones, los experimentos pueden ser obligados a largo plazo. Las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de 10x. Bar = 100 micras. Figura 1. (A) Un tiempo de 12 h experimento curso de N19 culturas OLG 48 h después de la transfección expresan RFP-MBP (canal rojo) junto con 3 l de 488 NucView sustrato (canal verde). Los cultivos fueron tratados con una concentración final de 80 mM [K +] (paneles de la izquierda), o ningún tratamiento en el control (paneles de la derecha). Las imágenes fueron adquiridas en intervalos de 6 minutos, y la activación significativa de exfoliados caspasa-3 (señal verde) se puede observard en los cultivos tratados con 80 mM [K +] dentro de los núcleos celulares (cuadro de hash) en comparación con el experimento de control. (b) Porcentaje de la caspasa-3 cortado las células (que se calcula dividiendo el número total de células en el campo de visión el número total de la caspasa-células positivas). En comparación con el control de las condiciones, se observó un 45% la muerte celular después de K +-tratamiento por 12 h. S-Video 1. Un tiempo de 12 h por supuesto experimento de N19-OLG culturas 48 h después de la transfección expresan RFP-MBP (canal rojo), con 3 l de 488 NucView sustrato (canal verde), junto con brillantes imágenes de campo y una de tres vías imagen fusionada, tras el tratamiento con 80 mM [K +]. S-Video 2. Un tiempo de 12 h por supuesto experimento de N19-OLG culturas 48 h después de la transfección expresan RFP-MBP (canal rojo), con 3 l de 488 NucView sustrato (canal verde), junto con el campo brillante images y una imagen de tres vías combinadas. No hay un tratamiento se aplicó a las culturas y N19-OLGs se puede ver a través de la migración campo del microscopio, en contraste con los cultivos celulares tratados con 80 mM [K +] (comparar con el S-Video 1).