İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz

1. Çözülme ve Kültürleme Hücreleri Uzun süreli sıvı azot mağazalardan donmuş ölümsüzleştirdi N19 oligodendroglial hücreleri stok alın. 37 ° C su banyosuna daldırın flakon içeren hücreler, hücre süspansiyonu, tamamen çözülene kadar. % 10 FBS (Fetal Bovine Serum) ve% 1 penisilin / 10 cm kültür plakasına streptomisin ile desteklenmiş yüksek-glukoz ile 7 mL DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta) ekleyin. Hücre süspansiyon plaka açılan, bilge ve hafifçe ajitasyon ve hücreler eşit olarak dağıtmak için Petri plaka kaya ekleyin. 34 ° C /% 5 CO 2 inkübatör Kültür hücreler. 4 saat sonra, dölveriminin olarak kullanılır olmuştu kalan DMSO (dimetil sulphoxide) kaldırmak ve taze medya (7 ml DMEM yüksek-glukoz medya% 10 FBS ile desteklenmiş ve% 1 penisilin / streptomisin) yerine plakaları aspirat medya . 2. Pasajlanması Hücreleri % 70-80,izdiham (4-7 gün büyüme), medya hücreleri aspire. Plaka için 1 ml% 0.25 tripsin ekleyin. Pipet tripsin hücreleri (yaklaşık 5 dakika) ayırmak için. Deneysel koşullar ve geçişi için uygun dilüsyonları bir hücre yoğunluğu az olduğu için 0.1 x 10 6 hücre / ml gelecek deneyler için ek bir 10 cm plaka olun. Not: deneyler için onları kullanmadan önce çözülme sonra en az iki kez geçit hücreleri gerekir. 3. Hücreler Sayma ve Kaplama Canlı hücre görüntüleme için plaka hücreleri için, daha önce açıklandığı gibi trypsinize. Hücreleri yaklaşık 30 mcL çıkarın ve bir haemocytometer kullanarak saymak. 6 plaka kaplamasız bir cam lamel yerleştirin. % 34 az 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ° C /% 5 CO 2 ile desteklenen 0.1 x 10 6 hücre / ml 2 ml fenol-DMEM yüksek glukoz medya yoğunluğu, iyi hücreleri ekleyin. Izin vermek34 (16-20 saat) gece boyu büyümeye hücreleri ° C /% 5 CO 2 transfeksiyon önce. 4. Transfeksiyon 100 mcL serum özgür medya, plazmid DNA ve 4 mcL FuGENE HD (Roche) 0,5-4 mg saflaştırılmış birleştirin. Vortex yavaşça karıştırın. Tekrar kısa bir süre vorteksleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DNA karmaşık ve daha sonra kültür hücreleri doğrudan FuGENE HD DNA karışımı ekleyin sağlar. Yavaşça karıştırın plaka yatırın. 34 ° C /% 5 CO 2 tedavi veya deney öncesinde ek bir 48 saat için Kültür hücreler. 5. Canlı Hücre Görüntüleme için hazırlık Hücreler (LCI) LCI Chamlide canlı hücre aracı kontrol kutusu üzerinde deney başlamak istiyorum önce en az 1 saat açın. Kontrol kutusu da LCI Chamlide içinde sıcaklık ve nem düzenler ve önceden karıştırılmış% 5 CO 2 akışını düzenler. Not: Bu tavsiye edilirbaşlayan deneyler tüm aşamada 34 ° C ye ulaştığı sağlamak için önce 3 saat kadar kontrol kutusunu açmak Bu adım, görüntüleme sırasında, odak kayması, ısıtır gibi metal sahne fluxulation ve ısıl genleşme neden olduğu azaltacaktır. Chamlide manyetik tip kültür odası, bir akış-luk Çalışma sprey ve cımbız,% 70 etanol ve 5 dakika kurumasını bekleyin. Inkübatör hücreleri çıkarın ve sağlıklı olduğunu onaylayın. Onlar yapışık görünür ve çok sayıda membran süreçleri ile cam lamel iyi yayılır. Transfeksiyon gelen vurguladı hücreleri deney için uygun değildir ve süreç uzantıları sayısı azaltılmış olacak ve genellikle düzensiz şekilli bir çekirdek kadroya sahip. 6 plaka Tilt ve cımbız ile lamel kaldırmak. Kültür odasının alt plaka hızla lamel hücrenin yan yerleştirin. Lamel kurumasına izin vermeyin. Manyetik ana takınkültür odası beden ve orijinal 6-lamel üstüne plaka medya 500 mcL ekleyin. Yeniden kullanarak bu ortamın çevresel değişikliklere yol açtığı hücrelerin üzerine yerleştirilen stres miktarı azalacak, hem de ekstraselüler salgıladığı faktörleri değerlendirmek için yararlı olabilir. Kültür odası cam kapak yerleştirin. Mikroskobu ile müdahale lamel altındaki herhangi bir kalıntı malzemeyi kaldırmak için% 70 etanol ile püskürtülür KimWipe kullanın. 34 kültür odası yerleştirin ° C /% 5 CO 2 kuvöz, 30 dk . Bu adım, odanın kendisi 34 ısıtır emin ° metal ısınır C lamel değişen azaltmak için. 6. Mikroskop Ayarlar Görüntüler özel bir röle lens ve kartuş yükleme için birden fazla tekerlekleri emisyon filtre salyangozunu (Çekirdek Technologies Inc, G Leica DMIRE2 inverted mikroskop kullanılarak elde edildiuelph, ON). Aydınlık – Lamba 2,5 V ve pozlama 240 ms zaman ayarlayın. Kırmızı Floresan Protein (RFP) – Kazancı 200 ms 140 olarak belirlenmiştir. Yeşil Floresan Protein (GFP) – Kazanç 500 ms 140 olarak belirlenmiştir. Mikroskop hücrelere ışık miktarını kontrol etmek için dönen bir disk yerine daha kısılabilir lambası vardır. Biz maksimum lamba yoğunluğu% 90 ile deneyler ışığında çalıştırın. 7. Apoptoz indükleyicileri ve NucView 488 Kaspaz-3 substrat Hücre Tedavisi Konsantrasyonları deneyler arasında tutarlı olacak şekilde, vaktinden önce apoptozis indükleyicileri büyük stoklar alikotları olarak hazırlamak ve onları dondurmak için çok önemlidir. NucView 488 yüzey ışığa duyarlı. -20 ° C alüminyum folyo kaplı dondurma / çözdürme ve mağaza tüpleri azaltmak için 15 mcL hacimde hazırlayın. NucV maruz kalmayı azaltmak için mümkün olduğunca düşük ortam aydınlatması ile çalışıniew 488 substrat kullanımı öncesinde, ışık. Hücrelerin sıcaklığı azalmaya maruz böylece inkübatör hızla kültür odası al. Kültür odasının mikroskop çevre odasının üzerine yerleştirin ve hareket kültür odası tutmak için kelepçeler kullanmak. Bu noktada oda ışıkları loş da olmalıdır. Çift regülatör ile% 5 önceden karıştırılmış CO 2 tank açın. 10x objektif kullanarak, parlak alan mikroskobu kullanarak bilgisayar monitörü hücreleri bulmak için odak Not: pozlama süresini azaltmak için istenen büyütme amacı, en büyük sayısal diyafram kullanmak isteyeyim. Halinde 80 mM potasyum, ya da 100 mM glutamat) hücrelerinin (apoptozis indükleyici sunun, aşağıdaki yöntemlerden biri kullanılabilir. Biz tipik bir kültür ortamı 10x konsantre olarak çözünmüş KCl kullanılarak, örnek olarak 80 mM potasyum teslim kullanabilirsiniz. Media döviz by yavaş ve yerel perfüzyon: – 80 mM potasyum içeren yeni medya kültürü odasında değişim medya peristaltik bir pompa kullanın. – Hortumun bir ucu odasından medya kaldıracaktır 10 ml, 80 mM potasyum fenol-DMEM çözünmüş bir stok ve hortumun diğer ucunu sunacak. – Odanın sol medya potasyum konsantrasyonu doğru olduğundan emin olmak için medya en az 10x döviz istiyorum. Medya alışverişinde sonra, odasında medya NucView 488 substratın 3 mcL ekleyin. Karıştırmak için Pipet. Direkt olarak 80 mM K + ve NucView 488 kültür odasında medya substrat: – 80 mM potasyum fenol-DMEM çözünmüş 10x stok solüsyonu hazırlayın. – 50 mcL 10x 80 mM potasyum NucView 488 substratın 3 mcL ekleyin. Karıştırmak için Pipet. 500 mcL fenol-DMEM kültür odasında ekleyin. Not: Bu yöntemEğer büyüme ya da özgün ortam mevcut olabilecek diğer salgıladığı faktörleri korumak veya değerlendirilmesinde ilginizi çekiyorsa tercih etti. Biz NucView 488 Yüzey sürece 36 saat süren deneyler için hücre kültürü kararlı olduğunu bulduk 8. Live-hücreli Görüntüleme Transfekte hücreler kırmızı kanal görüntülemek için tıklayın. Seçin ve bir düzine kare etrafında birkaç transfekte hücreler vardır ve bu "XY noktaları" kaydedin. Bilgisayar belleği miktarına bağlı olarak, elde etmek mümkün olacaktır sahne puan sayısı sınırlı olabilir. Bu kaydedilmiş aşamasında mikroskop yakalama görüntüleri (parlak alan, kırmızı kanalı ve yeşil kanal) var, her 6 dakikada bir işaret etmektedir. Deneylerinin erken aşamalarında görünen herhangi bir yeşil boyama muhtemelen transfeksiyon ve / veya çevresel stres nedeniyle genellikle zaten apoptozis gören hücreler, gösterir. Apoptdeneysel tedaviler nedeniyle osis deney daha sonraki bir timepoint tespit edilecektir. 9 – İstatistiksel Analiz Her bir deney için, verimli bir şekilde ayarlamak büyük bir veri toplamak için birden fazla XY puan elde etmek için mikroskop programı. Her deney yinelenen veya üç yapılır, ve veri, farklı günlerde yapılan ayrı deneyler derlenmiştir. Her bir veri kümesi, 15 alan görüş analiz ve kaspaz-pozitif hücrelerin (kaspaz-pozitif hücrelerinin toplam sayısı görünümü / alan hücrelerin toplam sayısı) kaspaz-negatif hücrelerin oranı karşılaştırmak. Her veri seti kaydedilen ölçümleri daha büyük bir örneklem kümesi halinde gruplandırılmış ve sonra bir ANOVA tablosu (p = 0.05) kullanılarak başka bir ile karşılaştırıldığında. Biz her bir deney (SEM) ortalama standart hataları göstermek ve sonra wh belirlemek için Tukey karşılaştırma testi anlamına gelir (p = 0.05) yaparak anlamına gelir farkı karşılaştırmakich tedavileri birbirinden önemli ölçüde farklıdır. 10. Temsilcisi Sonuçlar Biz NucView 488 substrat ekstrasellüler potasyum konsantrasyonu yüksek olan bir tedavi N19-OLG hücre kültürleri apoptozis oranında herhangi bir artış gösterir nasıl göstermek için bir deney tarif var. N19-hücreleri RFP ile transfekte ve ya 3 mcL NucView 488 substrat (kontrol), ya da 3 mcL NucView 488 substrat ve 80 mM ile tedavi edildi [K +] (tedavi). Hücreler monitorize edildi ve görüntüleri nörolojik hakaret (Şekil 1A) içeren çalışmalar için yeterli bir 12 saat zaman ders, üzerinden satın alındı. Kontrol koşullarında, 80 mM göre apopitoz önemli miktarda gözlemleyebilirsiniz vermedi [K +] 12 saat sonra (Şekil 1B) yaklaşık% 45 hücre ölümü gösterdi tedavi kültürleri (karma kutu). Arka plan yeşil sinyal gözlemlemekkontrol d ekstrasellüler potasyum ilavesi olmadan apoptozis gören hücreler gösterir. Diğer durumlarda deneyler uzun süre çalıştırmak için gerekli olabilir, ancak 12 saatlik bir zaman noktasında kontrol deneme sergi apopitoz hücrelerin hemen hemen hiçbiri. Görüntüler 10x objektif kullanılarak elde edildi. Bar = 100 mikron. Şekil 1. (A) A N19 OLG kültürlerin 12 saat zaman elbette deney 48 saat sonrası transfeksiyon NucView 488 substrat (yeşil kanal) 3 mcL ile birlikte RFP-MBP (kırmızı kanal) ifade. Kültürler ya 80 mM nihai bir konsantrasyon ile tedavi edildi [K +] (sol panelleri), ya da bir kontrol (sağ panelleri) olarak hiçbir tedavi . Görüntüler 6 dakika aralıklarla satın alındı ​​ve önemli bölünmüş kaspaz-3 aktivasyonu (yeşil sinyal) gözlemlemek olabilirbölünmüş kaspaz-3 hücreleri (görüş alanında hücrelerin toplam sayısına bölünmesiyle hesaplanan d 80 mM tedavi kültürlerde [K +] kontrol deneyi ile karşılaştırıldığında hücre çekirdekleri (karma kutu) içinde (B) Yüzde kaspaz-pozitif hücrelerinin toplam sayısı). Koşulları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, K + tedavi 12 saat sonra yaklaşık% 45 hücre ölümü gözlenen SVideo 1 N19-OLG kültürlerin bir 12 saat zaman elbette deney 48 saat aydınlık alan görüntüler ve üç yönlü bir NucView 488 substratın 3 mcL (yeşil kanal) ile birlikte, RFP-MBP (kırmızı kanal) ifade post-transfeksiyon Birleştirilen görüntünün, tedavi sonrası 80 mM [K +]. SVideo 2. N19-OLG kültürlerin bir 12 saat zaman ders deney 48 saat NucView 488 substratın 3 mcL (yeşil kanal) RFP-MBP (kırmızı kanal) ifade post-transfeksiyon, parlak alan imag ile birliktees ve üç yollu birleştirilen görüntü. Kültürlerin tedavi uygulandı ve 80 mM tedavi edilen hücre kültürleri aksine N19-OLGs mikroskop alanında aracılığıyla geçiş görülebilmektedir [K +] (1 svideo ile karşılaştırın) .