رصد المشقوق كاسباس 3 النشاط وموت الخلايا المبرمج للخلايا Oligodendroglial مخلد باستخدام خلايا حية التصوير وCleaveable ركائز Fluorogenic صباغة وبعد زوال الاستقطاب الناجم عن غشاء البوتاسيوم
Summary
تعيش خلية من الخلايا بوساطة التصوير كاسباس 3 في خلد الثقافات الخلية N19 – oligodendrocyte باستخدام<em> NucView</em> 488 كاسباس 3 الركيزة. هذا الأسلوب ينطبق على موت الخلايا المبرمج المقايسات في الوقت الحقيقي في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا والأنسجة.
Abstract
يمكن للنظام العصبي المركزي التجربة عددا من الضغوط العصبية والشتائم ، والذي يمكن أن يكون لها آثار سلبية عديدة تؤدي في نهاية المطاف الى خفض في عدد السكان وظيفة الخلايا العصبية. ويمكن إطلاق الجزيئات التالفة المحاوير مثير بما البوتاسيوم أو الغلوتامات في المصفوفة خارج الخلية ، والتي بدورها ، يمكن أن تنتج المزيد من الاهانة والضرر لخلايا الدبقية النجمية بما في ذلك دعم وoligodendrocytes 8 و 16. إذا استمرت الإساءة ، وسوف تخضع خلايا موت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج) ، الذي ينظم وتفعيلها من خلال عدد من شلالات راسخة نقل الإشارة 14. يمكن أن موت الخلايا المبرمج ونخر الأنسجة تحدث بعد إصابات في الدماغ ، نقص التروية الدماغية ، والنوبات. والمثال الكلاسيكي لتنظيم أفكارك هي السيستين عائلة تعتمد على البروتياز – اسبارتاتي الموجهة ، أو caspases. كما تم تفعيلها بما البروتياز caspases متورطين في موت الخلايا العصبية في استجابة لالمزمنةالأمراض التنكسية بما في ذلك مرض الزهايمر ، وهنتنغتون ، والتصلب المتعدد 4 ، 14 ، 3 ، 11 ، 7.
في هذا البروتوكول وصفنا استخدام الركيزة NucView كاسباس 3 488 لقياس نسبة موت الخلايا المبرمج 3 كاسباس توسط في خلد N19 – oligodendrocyte الثقافات الخلية (OLG) 15 ، 5 ، بعد التعرض لضغوط خارج الخلية مختلفة مثل تركيزات عالية من البوتاسيوم أو الغلوتامات. تم الحصول على مشروط ، خلدت خط الخلية N19 – OLG (الذي يمثل السلف O2A) من الدكتور أنتوني Campagnoni (UCLA سيميل معهد العلوم العصبية) 15 ، 5 ، وكان يستخدم في السابق لدراسة الآليات الجزيئية في التعبير الجيني الميلين ونقل الإشارة الرائدة لOLG التمايز (على سبيل المثال 6 ، 10). لقد تم العثور على هذا الخط الخلية لتكون قوية فيما يتعلق ترنسفكأيشن الخارجية مع البروتين الأساسي المايلين (MBP) يبني تنصهر فيها إما لطلب تقديم العروض أو GFP (أحمر أو أخضر بروتين فلوري) 13 ،12. هنا ، تم التعامل مع الثقافات الخلية N19 – OLG إما مع 80 ملم كلوريد البوتاسيوم أو الصوديوم الغلوتامات 100 ملم إلى محاكاة تسرب محواري في المصفوفة خارج الخلية للحث على موت الخلايا المبرمج 9. استخدمنا ثنائية وظيفية كاسباس 3 الركيزة التي تحتوي على (حمض الغلوتاميك – ASP – فال ASP) DEVD كاسباس 3 الوحيدات الاعتراف وصبغة الحمض النووي ملزم 2. الركيزة يدخل بسرعة السيتوبلازم حيث المشقوق من قبل الخلايا 3 caspase. يتم تحرير الصبغة ، NucView 488 و يدخل نواة الخلية حيث يربط الحمض النووي والأخضر في 488 نانومتر تتفلور ، مما يشير إلى موت الخلايا المبرمج. استخدام 488 NucView الركيزة – 3 caspase يسمح للخلية الحية التصوير في الوقت الحقيقي 1 و 10. في هذا الفيديو ، ونحن كذلك أن تصف وزراعة الخلايا ترنسفكأيشن من خلد N19 – OLG ، فضلا عن تقنيات التصوير الحية الخلية.
Protocol
Discussion
على الرغم من أن هذا ليس هو المنتج الوحيد fluorogenic المتاحة للكشف عن موت الخلايا المبرمج ، وهناك العديد من المزايا الهامة لاستخدام 488 NucView الركيزة. واحدة من الفوائد الرئيسية هي القدرة على متابعة موت الخلايا المبرمج في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي ، في حين أن معظم المنتجات البديلة تتطلب إما تحلل الخلية أو الفقراء نفاذية الخلية. وتشمل المزايا الأخرى للحساسية عالية كاسباس 3 الاعتراف ، وارتفاع نفاذية الخلية ، السمسة منخفضة ، وعدم التدخل في تطور الخلايا. الركيزة كما منخفضة مضان الخلفية حتى يتم ذلك المشقوق ويدخل النواة ، الذي يلغي مضان الخلفية. تسلسل كاسباس 3 الاعتراف يحتوي على 3 الشحنات السالبة وصبغ الحمض النووي ملزم واحد شحنة موجبة 2. وDEVD – NucView 488 جزيء وبالتالي تهمة صافية سلبية ، مما يحول دون تفعيل وملزمة للصباغة على الحمض النووي في الخلايا حيث caspase غير نشطة.
أماهمطلوب التناسق بين intaining التجارب لتكون قادرة على عقد مقارنات ذات مغزى بين مكررات. واحدة من المعالم الرئيسية للحفاظ على كثافة الثابت هو الخلية ، كما أنه يؤثر على معدل ترنسفكأيشن. الحصول على معدلات عالية في خلد ترنسفكأيشن N19 – OLG الثقافات الخلية هي أكثر صعوبة من غيرها مع خطوط الخلايا الشائعة مثل هيلا أو HEK293 ، وتعتمد بدرجة كبيرة على الكثافة ، وتجربتنا في 12 و 13. وقد تم الحصول على الكفاءات وسعنا ترنسفكأيشن لهذه الخلايا مع HD Fugene (روش) ، وعادة ما يقرب من 15 ٪ ، ولكن يمكن أن تصل إلى أكثر من 30 ٪ ، اعتمادا على بناء. سيكون حذرا العد الخلية المساعدات في الحصول على أسعار ترنسفكأيشن متناسقة. من المهم أيضا للكشف عن خلايا من علاجات مختلفة لنفس الدرجة من الإجهاد البيئي ، وبخاصة عندما قياس معدلات موت الخلايا المبرمج. على وجه التحديد ، وطول الفترة الزمنية التي يتعرض لها أكثر من الخلايا لالكواشف ترنسفكأيشن ، أو مقدار التعرض للضوء ، أهمية بيئية فاريABLES للنظر ، وينبغي أن تظل ثابتة عبر التجارب. لتقديم الطلبات ، لدينا وجدت أن جمع عدد كبير من حقول للرؤية يوفر حجم عينة كبيرة بما فيه الكفاية لإجراء مقارنات إحصائية كبيرة ، [المرجع السابق].
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا المختبر من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة ، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث وكندا ، وجمعية التصلب المتعدد في كندا (MSSC). وكان GSTS المتلقي لدراسية لدرجة الدكتوراه من MSSC. نحن ممتنون للدكتور جوان بوغز (مستشفى الأطفال المرضى ، وتورونتو) لإجراء مناقشات مفيدة كثيرة وتعليقات على هذه المخطوطة. ونحن ممتنون لBiotium لبيع الهدايا السخية من NucView إضافية 488 كاسباس 3.
Materials
Table of specific reagents and equipment
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
|---|---|---|
| NucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells | Biotium | 30029 |
| FuGENE HD transfection reagent | Roche | 04709705001 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 31053-028 |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 15050-065 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 |
| #1.5-25 mm glass coverslip | Warner Instruments | 64-0715 |
Chamlide CMB magnetic |
Quorum Technologies | CM-B-40 |
| Cellstart tissue culture 10 cm dishes | VWR | 82050-576 |
| BD Falcon 6-well tissue culture dishes | VWR | CA62406-161 |
References
- Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening. J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).
- Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells. FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).
- de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. Caspase activation precedes and leads to tangles. Nature. 464, 1201-1204 (2010).
- Eldadah, B. A., Faden, A. I. Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury. J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).
- Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation. Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).
- Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins. Glia. 58, 1292-1303 (2010).
- Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination. Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).
- Lau, A., Tymianski, M. Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration. Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).
- Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo. J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).
- Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells. J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).
- Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M. Caspases in Huntington’s disease. Neuroscientist. 7, 480-489 (2001).
- Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes. J. Neurosci. Res. , (2011).
- Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms. J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).
- Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury. Nat. Med. 5, 943-946 (1999).
- Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus. J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).
- Yu, S. P. Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis. Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).
