Scale-up di colture cellulari di mammifero utilizzando un pallone nuovo multistrato

1. Protocollo da utilizzare Multi-fiasche per colture cellulari Preparazione dei vasi e l'aggiunta di sospensione cellulare Preparare la crescita media delle cellule, se necessario. Line up multi-Flask verticalmente su un lato con il tappo rivolto verso l'alto sul piano di lavoro (cappa a flusso laminare sterile). Questi contenitori sono disponibili in 3 e 5 strati formati e utilizzare un simile flusso di lavoro come un modello T-175 pallone. Allentare e rimuovere i tappi. Aggiungi quantità richiesta di pre-riscaldato mezzo in fiasco con una pipetta da 50 o 100 ml o per infusione. Pipette che sono ≤ 10 ml può raggiungere il fondo del recipiente in cui Multi-fiasche sono posti verticalmente con tappo rivolto verso l'alto. Pipette ≥ 10 ml può raggiungere in nave subito dopo il logo sul Multi-Flask, fornendo così un portale comodo per creare maggiori volumi di supporti per nave. Per evitare bolle di media, permettono flusso di liquido di flow lungo la parete interna della Multi-Flask coperchio (logo-side). Aggiungi sospensione cellulare da uno stock di cellule concentrate in terreno di crescita attraverso lo strato superiore con una pipetta 10 ml e fiaschi cap. Suggerimenti: – Trasporto Multi-fusti a un carrello al sito incubatore ed eseguire passaggi rimanenti. – La densità di semina delle cellule varia a seconda del tipo di cellula, medio e durata bisogno di cultura. Iniziare con la densità di semina e il volume dei media a quello usato nello standard T-175 palloni e moltiplicare per 3 o 5 a seconda della Multi-Flask formato utilizzato. Miscelazione di cellule Mix posizione: Tenere il Multi-Flask verticale con il logo rivolto verso di voi e girare in senso antiorario ad un angolo di 45 ° con porta mix rivolto verso l'alto. Tenendo lo stesso angolo, leggermente inclinare Multi-Flask da davanti a dietro (collo lontano da voi) fino liquido nello strato superiore scarichi completamente downwards attraverso la porta mix. Perno sul mix di babordo. Allo stesso modo, dolcemente rocce multi-Flask da dietro in avanti (collo verso di voi) fino a metà scarichi completamente dallo strato basso verso l'alto attraverso la porta mix. Ripetere i punti 1.2.2 e 1.2.3 ancora una volta per garantire la corretta miscelazione. Portare Multi-Flask in posizione mix (Fase 1.2.1) e passare al punto 1,3 In alternativa, la sospensione di cellule possono essere preparati esternamente dalla Multi-Flask e la sospensione cellulare possono essere aggiunti alla nave usando una pipetta o da dolci versando. Porto mix permette in-vaso di miscelazione delle cellule con i media ed elimina la necessità di fare grandi volumi di sospensioni cellulari esternamente. Consente inoltre l'equalizzazione dei media attraverso gli strati della Multi-Flask Equilibrio del fluido Dopo la miscelazione / aggiunta di sospensione cellulare, luogo multi-Flask in verticale su una superficie di lavoro piana per pareggiare il volume liquido equazionelly in tutti gli strati. Liquido partizione in ogni strato Tenere premuto il Multi-Flask con il logo rivolto verso l'alto e ruotare in senso orario ad un angolo di 45 ° per partizionare il liquido in ogni livello. Suggerimento: – Per ottenere i migliori risultati, è importante utilizzare una superficie piana di lavoro per i passaggi 1,3-1,4 Trasporti Una volta che i supporti contenenti sospensione cellulare viene partizionato, il trasporto multi-Flask allo stesso angolo di 45 ° (in senso orario) come al punto 1.4.1 con il supporto di distanza dal porto mix in incubatrice. Questa posizione è adatta anche quando si rimuove fiaschi da incubatore per la visualizzazione su un microscopio. Posizionamento Multi-Flask su incubatore scaffale Tenendo Multi-Flask al 45 ° (in senso orario, lontano dal mix-port), ruotare delicatamente verso il basso orizzontalmente sulla superficie incubatore (utilizzando l'angolo lontano dalla porta come un mixpivot). Lay Multi-Fiasca con il logo rivolto verso l'alto. Falcon Multi-Flask progettazione consente ai pescherecci di essere impilati e li tiene in posizione da una nervatura robusta accatastamento. Distribuzione di cellule e reagenti Dopo aver posizionato Multi-Flask piatta sulla superficie di lavoro, dolcemente dondolare avanti e indietro e da lato a lato per distribuire le cellule in modo uniforme su superfici cultura facendo attenzione a non versare liquidi di ogni strato. Stack fiaschi. Questo Flask è fatta di materiale otticamente trasparente e celle l'ultimo strato possono essere facilmente visualizzati su un microscopio. Mezzi di scambio Aspirare mentre inclinando il Multi-Flask a sinistra (mix porta-side) con il logo rivolto verso l'alto. Poi inclinazione, il Multi-Flask a destra, continuando ad aspirare tutti i media residua. Aggiungi quantità appropriata di media e seguire i punti da 1,3-1,7 2.La raccolta delle cellule da Multi-fiasche Dissociare le cellule, in fila Multi-Flasks verticale e portare a ciascuno di Mix posizione (punto 1.2.1). Capovolgere delicatamente palloni con il collo rivolto verso di voi in modo da consentire ai media di scarico per lo strato superiore della Multi-Flask. Inserire una punta di 5 o 10 ml aspirare attraverso il collo fino a raggiungere il livello del liquido nei pressi del porto mix. Aspirare il terreno esausto. Aggiungi dissociazione reagente / tampone di lavaggio e portare a Mix posizione come nel passo 1.2.1, quindi procedere e seguire i passaggi 1,3-1,7. Neutralizzare con mezzo di crescita / neutralizzazione e versare sospensione di cellule in una provetta di ricezione o invertire fiasco tale che le cellule di scarico per lo strato superiore della nave e raccogliere le cellule con una pipetta 10 ml. Suggerimento: per favorirne il recupero di cellule o reagenti, portare Multi-pallone per mescolarne posizione (punto 1.2.1), invertire con il collo verso l'operatore per permettere il drenaggio completo dei media da al strati l per lo strato superiore. Poi, inclinazione Multi-Flask in senso orario per angolo di 45 ° (lontano dal porto mix), mentre il Multi-Flask rimane invertita. Utilizzare una pipetta (1-10 ml) per raccogliere tutti i reagenti rimasti. 3. Consigliato volume di lavoro in Falcon Multi-fiasche La crescita dei media 3-Layer: 75-150 ml per Multi-Flask 5-Layer: 125-250 mL per Multi-Flask Dissociazione agente 3-Layer: ≥ 15 ml per ogni Multi-Flask 5-Layer: ≥ 25 ml per Multi-Flask Suggerimento: Inizia con volume medio usato in standard T-175 palloni e moltiplicare per 3 o 5 volte a seconda della multi-formato Flask valutata in modo che mL per unità di superficie rimane la stessa. 4. Rappresentante dei risultati: 1. Disegno di Falcon Multi-Flask files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/> . Figura 1: Multi-Flask vasi coltura cellulare sono disponibili in 3 – e 5-strato formato stackable di scale-up delle cellule fornendo 525 e 875 cm 2 di superficie di crescita, rispettivamente. Pipetta di accesso facilita aggiunta e la rimozione delle cellule e reagenti in e fuori della nave. Presenza di mix-port consente una rapida in-vaso di miscelazione ed equalizzazione dei media in tutti gli strati della Multi-Flask. 2. Yield cellulare con Multi-Flask: Questi vasi sono disponibili in 3 strati e 5 strati formati che corrispondono a 3 e 5 volte la superficie di T-175 fiaschi. Di conseguenza, ≥ 3 e 5 volte (130 ± 6,8 x 10 6 e 218 ± 23,6 x 10 6 cellule, rispettivamente) il numero di BHK-21 (bambino renali di criceto), le cellule sono state coltivate e recuperati da Multi-Flask rispetto al T-175 fiaschi (43,2 ± 3,5 x 10 6 cellule; Fig.2a). Produzione di cellule per usuperficie nit era equivalente a 3 – e 5-layer multi-Palloni e T-175 palloni per BHK-21, LNCaP (adenocarcinoma prostatico umano linea cellulare), Hep-G2 (linea di cellule di epatocarcinoma umano), Ecopack 2-293 (umano linea cellulare di rene) in coltura per un periodo di 48-96h (Fig.2b) in terreni di coltura (35 ml per strato), come raccomandato dal fornitore cellulare (ATCC, Sigma e / o Clontech). Le cellule sono state elencate in un sistema automatizzato Vi-CELL contatore (1). Figura 2A: tre e cinque volte il numero di cellule BHK-21 sono stati coltivati ​​e recuperati da 3 – e 5-strato Multi-fiasche rispetto al T-175 fiaschi. Rendimento atteso è stata determinata utilizzando rendimenti medi dal controllo delle cellule T-175 fiaschi moltiplicato per tre volte e cinque per il 3 – e 5-strato Multi-fiasche rispettivamente (n = 4 flaconi / formato). <br/ Figura> 2B: resa celle per cm 2 è stato equivalente a 3 – e 5-layer multi-Palloni e T-175 palloni per BHK-21, LNCaP, HepG2 e EcoPack2-293 cellule. Ogni barra rappresenta la media di 4-6 fiaschi. BHK-21 (11.000 cells/cm2) sono state coltivate per 72 ore, le cellule LNCaP (20.000 cells/cm2) e EcoPack2-293 cellule (~ 35.000 cells/cm2) sono state coltivate per 96 ore e cellule HepG2 (25.000 cellule / cm 2 ) sono state coltivate per 48 ore prima del raccolto. 3. Distribuzione media tra strati di multi-Flask Terreno di coltura cellulare (DMEM, Invitrogen) è stato aggiunto a 5 strati multi-Palloni (250 nave mL/5-layer) e suddiviso in strati secondo il protocollo sopra descritto. Distribuzione dei media è stata misurata mediante fori in ogni strato e media pompato fuori da singoli livelli. Peso del liquido recuperato da ogni strato è risultata essere relativamente uniforme da un livello all'altro come mostrato in Fig. 3. Essi sono i seguenti: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (gm). Figura 3. Uniforme distribuzione dei media in ciascuno dei cinque strati di un 5-strato Multi-Flask. Terreno di coltura cellulare è stato aggiunto al Multi-Palloni (250 nave ml/5-layer), equilibrato e diviso per singoli livelli. Il supporto è stato pompato fuori attraverso fori praticati nei singoli strati e il peso del liquido è stato registrato da ogni strato (n = 6 bottiglie). 4. Distribuzione tra gli strati di celle multi-Flask Le celle possono essere aggiunti e mescolati all'interno del Multi-Flask. Abbiamo simulato la distribuzione di cellule tra gli strati di multi-Flask utilizzando perline (10μm; Polysciences Inc.) di dimensioni simili a celle. Sospensione tallone è stato aggiunto in Multi-Flask nave con una pipetta 10 ml attraverso lo strato superiore e mescolato con i media nel vaso come discribed nel protocollo di cui sopra. Distribuzione tallone è stata misurata mediante fori in ogni strato e fluido contenente sospensione tallone è stata pompata fuori dai singoli livelli. Concentrazione tallone recuperato da ogni strato è stato letto su un contatore Coulter e registrati. Qui sotto sono equivalenti distribuzioni tallone inter-strato a 3 strati multi-Palloni (Fig.4A). Il mix-porta consente una distribuzione omogenea di cellule e reagenti tra Flask multi-strati. Figura 4A: Bead distribuzione in ognuno dei tre strati di un 3-strato Multi-Flask. Una sospensione di perline (3,6 x10 6 / ml) è stato aggiunto al medio erogato in Multi-Palloni (sospensione perle: il volume dei media è di 1:10, vol: vol) e misti, seguiti da fasi di separazione e di equilibrio utilizzando il protocollo descritto. Concentrazione tallone recuperato da ogni strato (medio pompato attraverso fori praticati su ogni livello) è stata letta su un conte Coulterer e registrati. Qui sotto sono equivalenti distribuzioni tallone inter-layer 3 – strato Multi-Palloni (n = 5 palloni) Mostrate di seguito sono immagini rappresentative di Ecopack 2-293 pattern di colorazione delle cellule cresciute a confluenza> 80% sul 3-strati multi-fiasche in terreni di coltura integrata. Monostrati cellulari sono stati fissati e colorati con cristallo viola e multi-Flask strati sono stati poi tagliati e immagini digitalizzate (2). Nota, patterning cellulare è stata omogenea su tutti i livelli di Multi-Flask (Fig.4b). Risultati simili sono stati ottenuti con più tipi di cellule valutato (dati non riportati). Figura 4B: Questa figura illustra la crescita omogenea delle cellule tra gli strati di multi-fiaschi. Ecopack-2-293 cellule cresciute a confluenza> 80% in 3-strati multi-Palloni e T-175 sono state fissate e colorate con violetto cristallo. Multi-Flask navi sono state tagliate e ogni strato colorato è stato scansionato. 5 Alimentazione aria in Multi-Flask.: Analisi dei mezzi di comunicazione speso utilizzando BioProfile FLEX analizzatore (3,4) (Nova Biomedical) da EcoPack2-293 cellule in coltura per 96 ore hanno rivelato alcuna differenza di saturazione dell'aria di cellule cresciute in 5 strati multi-fiasche vs T-175 flaconi (81,03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% ambient O 2). Figura 5: Aria di saturazione (% ambient O 2) di media spesi erano simili in pre-mixed media da 5 strati multi-fiasche vs T-175 fiaschi. EcoPack2-293 cellule sono state seminate ad una densità di 35.000 cellule / cm 2 e coltivate per 96 ore prima analisi dei media (n = 3 palloni).