Implantação intracraniana com 3D subseqüentes In Vivo Bioluminescent imagem de Gliomas murino

1. Cultura de células A linhagem celular GL26 foi obtido a partir da Divisão de Tratamento e Diagnóstico do Câncer (DCTD) National Cancer Institute (NCI), Frederick, MD. Para facilitar a medição quantitativa da taxa de crescimento do tumor GL261 células foram feitas usando o bioluminescentes Lentiphos HT System (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) com o Lenti-X HT Embalagens Mix (Clontech Laboratories, Inc.) eo FUW- GL plasmídeo (a generosa doação do laboratório de JB Rubin, MD, PhD). As células foram mantidas em meio Dulbecco Modificado de Águia (DMEM) com 10% de tetraciclina sem soro fetal bovino (FCS; Clontech Laboratories, Inc.). GL261 células também foram estavelmente transfectadas com o gene de codificação luc2 usando o pGL4.51 [luc2 / CMV / Neo] condições vector (Promega Corp, Madison, WI) e FuGENE Reagente Transfection 6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) seguir especificado pelo o fabricante. O gene luc2 é uma versão otimizada do códon firefly Luciferasi que fornece uma saída de luz significativamente maior do que o gene luc padrão. Transfectants estável foram selecionados e mantidos em meios DMEM contendo 10% SFB e 100 mcg / ml Geneticin (G418, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Antes da implantação da cultura de células são colhidas por trypsinzation, lavado uma vez em DMEM sem soro e ressuspenso em DMEM sem soro com uma concentração de 1 x 10 7 células / ml. 2. Cirurgia Setup 2 Um ambiente estéril é mantida durante toda a cirurgia, incluindo todos os instrumentos cirúrgicos, suprimentos, luvas, cortinas, etc. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr dez semanas de idade (C57BL albino / 6) os ratos são comprados do National Cancer Institute em Frederick Programa de Produção Animal e utilizado em um peso médio de 20 gramas (NCI, Frederick, MD). Os animais são anestesiados por injeção intraperitoneal de xilazina (5 mg / kg), ketamina (50 mg / kg) e buprenorfina (0,05 mg / kg). Parapinch e é feito para garantir que o animal é anestesiado adequadamente antes da cirurgia é iniciada. Movimento (mesmo que pequena) de qualquer parte do animal é uma indicação de uma redução do nível de anestesia. Animal é imediatamente dado um adicional de 3,3 xilazina mg / kg e 26,6 ketamina mg / kg. Temperatura do corpo é mantido usando uma lâmpada e compressas estéreis cobrindo o corpo. Uma vez que o animal esteja devidamente anestesiado, eles são colocados sobre a cama amortecida do headframe estereotáxica (Modelo 900 de Pequenos Animais estereotáxica, David Kopf Instruments) [Figura 1]. Uma pequena quantidade (1 / 4 de polegada) de AKWA Pomada Oftálmica Lubrificante Lágrimas é aplicado sobre a córnea. O animal está garantido no quadro estereotáxico, abrindo a boca do animal (colocando o dedo indicador eo polegar em torno da mandíbula do animal) e deslizando os dentes da frente superior no recuo no quadro estereotáxico. O grampo é apertado para proteger a cabeça do animal para o fone de ouvido certificando-se que thcabeça e está alinhada e os olhos estão centrados, certificando-se no entanto a não exercer força excessiva sobre a cabeça do animal. O 2 mangueira é gravada para baixo perto narinas do animal. Fluxo de oxigênio é de 0,5 l / min. A parte inferior das costas e da cauda é gravada até a cama estereotáxica tomando cuidado para não comprometer a respiração. O local da incisão cirúrgica é raspada. Sticks povidine Iodo-Swab são usados ​​para lavar a área entre os olhos voltando para a área entre as orelhas com iodo, certificando-se o iodo não escorre nos olhos do animal. As células são preparadas para o implante imediatamente antes da cirurgia e são periodicamente misturado para garantir que eles não resolvem. A 10 mL, 50 mm Instrumento de precisão Mundial (WPI), Sarasota, FL, 26 seringa com agulha chanfrada é carregado com o inóculo celular. Se as células parecem ser aglutinados, pode ser necessário para recarregar a seringa. A seringa 10 ml é então colocado no Ultram UMP3-1icroPump micro injector (WPI, Sarasota, FL). 3. Implantação intracraniana 2 A incisão na pele é feita usando um tamanho de 15 lâmina de bisturi e pinças dentadas. Uma incisão é feita 10-15 milímetros longitudinalmente a partir de entre os olhos do animal, em direção as orelhas do animal expor o bregma (junção das suturas sagital e coronal, na parte superior do crânio). Certifique-se de identificar corretamente o bregma para ele pode ser facilmente confundido com a área do seio que é distal ao bregma [Figura 2]. Depois que o animal é sedado ele recebe uma injeção intra-incisional de 0,25% (2,5 mg / ml) de bupivacaína. A burrhole é feita 0,1 milímetros posterior ao bregma e 2,3 milímetros para a direita da linha média por lentamente torcendo um calibre 16 1 ½ polegadas de agulha com a mão, aplicando pouca pressão para a agulha, enquanto torcer até o crânio é penetrada eo cérebro está exposto. A agulha da seringa é movida para baixo para a posição usando o ste microdrivetitular seringa reotactic até que apenas toca a superfície do cérebro. A partir desta posição, a agulha é avançada no cérebro a uma profundidade de 3 mm e mantido no lugar por 3 minutos. A agulha é retirada 0,4 milímetro a uma profundidade total de 2,6 mm abaixo da superfície do cérebro, criando uma pequena bolsa onde as células estão a ser infundido. É opcional a este ponto para obter uma imagem de raios-X da agulha no animal para garantir a colocação correta e profundidade. A suspensão de células é administrada durante três minutos usando o injector micro ajustado para um volume de 2.000 nL (2 mL), com uma taxa de perfusão de 667 nL / minuto. A agulha é deixada no local por 2 minutos para evitar fugas do local de infusão. A agulha é retirada lentamente completamente. O burrhole é preenchido com cera de osso através de um dissector Penfield. A incisão é suturada com um 4-0 (1,5 métrico) de sutura vicryl certificando-se sem grandes lacunas são deixadas na pele. Vicryl é um material de sutura que se dissolvems, e, portanto, as suturas não precisam ser removidos quando a incisão é curado. Após a cirurgia os animais são colocados em uma gaiola sob uma lâmpada de aquecimento que é colocada na altura exigida para aquecer a superfície do fundo da gaiola a 30 ° C. Quando os animais são totalmente acordado (a julgar pelo movimento normal na gaiola) são devolvidos ao ambiente do grupo. Ibuprofeno oral é adicionado à água, por cinco dias no pós-operatório. 100 mg de ibuprofeno crianças (100mg/5ml) é adicionado a uma garrafa de 473 ml de água padrão de roedores. Os animais são observados diariamente e fotografada e pesados ​​a cada 3 dias. Duas semanas de observação pós-implantação é aumentada para duas vezes por dia. Os animais são sacrificados quando mostram sinais de declínio da saúde que inclui postura encurvada, mobilidade reduzida e perda de peso visível do corpo (≥ 20%). Estes sintomas são uma resposta publicada ao tumor e reproduzível aparecem aproximadamente 1 dia antes da morte devido ao tumor. 4. In vivo </Imagem los Bioluminescência> 3 Iniciar o [imagem viva] software. O IVIS Imaging System é inicializado, clicando no [Inicializar Sistema IVIS] botão no lado inferior direito do painel de controle. Selecione [Luminescent] Modo de imagem no lado superior esquerdo do painel de controle. Para determinar o tempo ideal de imagem após a injeção de um estudo cinético luciferina é necessário [Figura 3]. Esta descrição é para firefly luciferase; Injetar 10μl / g peso corporal de D-luciferina firefly (15mg/ml em PBS; Caliper Life Sciences Catálogo XR-1001 ou um produto similar de outro fornecedor) para o animal, como descrito abaixo. Espere 3 minutos, e depois anestesiar o mouse, colocando-o na câmara de anestesia de gás (2% de gás isoflurano em O 2). Desligue a anestesia de gás para a câmara e abrir a válvula de anestesia e do vácuo ao colector IVIS. Colocar imediatamente o animal sedadosobre a plataforma de imagem de temperatura controlada, certificando-se narina dos camundongos é devidamente colocado no coletor de anestesia de gás. A primeira imagem deve ser tomado cerca de 5 minutos após a injeção luciferina. Até 5 animais podem ser visualizados ao mesmo tempo no instrumento IVIS Spectrum. Se menos de 5 animais estão a ser trabalhada, é possível ligar o distribuidor não utilizado (s) para conservar o gás isoflurano. Continuar a tirar fotos a cada 3 minutos, criando uma seqüência de até uma hora para gerar uma curva de cinética de expressão luciferina. Clique no botão [Setup Sequence] botão no painel de controle. O editor de seqüência aparece. No painel de controle, especifique as definições para a primeira imagem de bioluminescência na seqüência. Nós recomendamos começar com Binning Médio. Também recomendamos Auto-exposição para determinar o tempo de exposição ideal. Selecione [Atraso] botão no editor de uma seqüênciand especificar um tempo de atraso de 3 minutos entre cada aquisição. Clique em [Add] no editor de seqüência. Parâmetros de aquisição são então adicionados à tabela. Repita o passo 4 para cada imagem na seqüência. Uma vez que a curva é estabelecida, o tempo ideal de imagem pode ser determinada traçando a intensidade do sinal (intensidade) versus tempo. Animais de imagem no momento de maior in vivo fóton contar para obter o sinal mais forte e mais preciso. Os primeiros experimentos utilizado injeção (ip) intraperitoneal de luciferina, no entanto, as injeções ip ocasionalmente resultaram em resultados intermitente mostrando pouca ou nenhuma bioluminescência no tumor. Trabalhamos com a hipótese de que a ausência ocasional do sinal aleatório deveu-se à entrega da luciferina para o intestino ou outros órgãos internos. Por isso, começou a via subcutânea (sc) luciferina injeções e viu reprodutibilidade maior imagem [Figura 3]. Vinteminutos após a injeção sc, os animais são anestesiados, colocando-os em uma câmara com 2% de gás isoflurano em O 2 até que eles não respondem. O animal anestesiado (s) são movidos para a câmara de imagem. Pomada oftálmica deve ser usado para o estudo cinético por causa do comprimento da imagem. Não é necessário para os procedimentos de outras imagens, porque eles são de curta duração. A imagem é adquirida no binning médio com um tempo de exposição de 5 minutos. A opção de aquisição de automóveis também pode ser usado. Se o sinal é saturado e / ou desmaio em binning média, o tempo binning ou exposição pode ser ajustado. Os arquivos de programa e os comentários de imagem subseqüentes são salvos no diretório do computador do usuário. 5. Imagem 3D 3 Clique na guia [Imagem Wizard] na [Setup Sequence] janela do painel de controle. Selecione [Bioluminescência] modo de imagem na tela de imagem e iniciar o Assistente de click [Next]. No "Bioluminescência – DLIT" janela do assistente de imagem, selecione o [Firefly] sonda repórter. A emissão / excitação do espectro selecionados fonte firefly aparecerá com as seis seleções de filtro correspondentes a serem adquiridos. A última tela aparecerá com opções padrão que incluem parâmetros de exposição automática e uma aquisição de Campo de configurações padrão Ver C. funcionam muito bem, no entanto, essas configurações podem ser modificadas se necessário. Clique em [Next] e da janela do editor de seqüência será preenchida com a seqüência de seis regiões do espectro em 20 nm filtros de largura (560 nm, 580 nm, 600 nm, 620 nm, 640 nm, e 660nm). Pressione [Adquirir Sequence]. O primeiro filtro (560 nm) vai incluir um padrão de luz estruturada usando um galvanômetro laser para estabelecer a topografia da superfície. Selecione [Topografia da Superfície] guia na paleta de ferramentas. Suavização da superfície pode ser aplicada a conta, por qualquer ângulo agudo criado durante o processo de reconstrução. Osuavização padrão baixo é recomendado. Clique em [Criar] ea caixa de análise de tomografia vai aparecer. Desenhar uma caixa de corte que inclui todo o animal e depois clique em [Next]. A ferramenta de limite vai aparecer como uma máscara roxa sobre a região selecionada. A máscara deve ser automaticamente configurado para combinar com a fotografia do animal. Se necessário, ajustar o limite da máscara para caber mais adequadamente o contorno do animal. Clique em [Finish] e reconstruída a malha irá aparecer. A reconstrução pode ser guardada na aba resultados. Na sequência da criação da topografia da superfície do animal, proceder à [DLIT Reconstrução 3D] suspensa sobre a paleta de ferramentas. Sob o [Análise] guia selecionar todos os seis comprimentos de onda para executar a reconstrução. Desmarque imagens que rendeu pixels saturados ou contagens abaixo de 600. Deixar as configurações em [Parâmetros] guia como padrão. Sob a guia [Propriedades], "Muscle" deve ser listada como a opção padrão paraPropriedades de Tecidos r, e "Firefly" deve ser listado como o espectro da fonte. Clique em [Reconstruir] no separador Analisar, ea reconstrução 3D da superfície do animal e da reconstrução correspondente da fonte de sinal deve aparecer [Figura 4]. Para determinar a localização e intensidade de sinal, selecione o botão Voxels na guia Ferramentas de 3D da paleta de ferramentas. Desenhar um quadrado em torno de todos os voxels exibidos e as medições de fluxo total é mostrado na parte inferior da guia volume. Clique em [Centro de Massa] para identificar a localização do sinal da voxels selecionado. Coronal, sagital e fatias transaxial do animal vai aparecer e usando o [Display Cursor Medida] a distância da superfície do animal para o centro voxel pode ser medido. Por favor, consulte o Manual do Usuário do Software Vivendo imagem para obter mais informações sobre o co-registro de atlas de órgãos e outros recursos avançados. 6. Um dos dadosNÁLISE 3 Depois que a imagem é adquirida e salvo, acessar o arquivo do programa, clicando no botão [Procurar] e selecionando o arquivo. As informações da imagem pode ser encontrado em [View] → [Informações da imagem]. A intensidade do sinal podem ser quantificados, selecionando o botão Região de Interesse (ROI) [ROI Tools]. Verifique se a imagem é analisada sob o modo [Photon], selecionando "Photon" na lista drop-down no canto superior esquerdo do painel de controle de imagem. Selecione o [Medida ROI] botão do "tipo" drop-down list. Selecione a forma ROI de interesse; opções incluem Circle, Square, e ou Grade. Cobrir todas as áreas de intensidade na imagem adquirida. A posição ROI é definido arrastando a seleção de forma ROI para a região que contém o sinal bioluminescente. A intensidade do sinal do ROI é calculado clicando no botão [Medida] botão. A etiqueta exibe a intensidade ROI. ROI pode ser gerida e salvo using o software imagem viva. 7. Resultados representativos: Implantação de células de sucesso é evidente quando as células implantadas são detectáveis ​​usando o espectro IVIS no dia da cirurgia. Ambos GL261 e GL261-luc-luc2 células são detectáveis, no entanto, o gene luc2 irá fornecer um maior nível de bioluminescência [Figura 5]. Imagens tiradas logo após o implante pode ter não-específicos de sinalização nas patas do animal e do nariz, que deve ser desconsiderada como pano de fundo. Sinal situado no local de implantação é real e que o sinal vai aumentar com o tempo [Figura 6]. O declínio na intensidade do sinal no dia 6 é reproduzível e, provavelmente, devido à perda de tumor levar por algumas das células implantadas. Medidas quantitativas de carga tumoral são reprodutíveis em que eles devem subir de forma constante até que o animal finalmente sucumbe à doença. No entanto, as curvas de crescimento dependerá em grande parte do estado de células implantadas, ou var e menores inevitável ESPONSABILIDADE no procedimento de implante. Nosso laboratório optou por animais implantados imagem a cada três dias. Figura 1. Após o mouse está devidamente anestesiado, ele é colocado no quadro estereotáxico. O cabeça de rato está protegido usando a braçadeira de boca. Figura 2. Depois que a pele é aberto os principais marcos anatômicos são identificados, inclusive incluir o bregma, as suturas coronal e sagital. O burrhole é feita 2,3 milímetro à direita do bregma pela lentamente torcendo um calibre 16 1 ½ polegadas, com agulha de uma pequena quantidade de pressão até que o crânio é penetrada eo cérebro está exposto. Figura 3. Uma comparação cinética do subcutâneo (iles/ftp_upload/3403/3403fig3_1.jpg "alt =" Figure3.1 "/>) versus intraperitoneal ( ) Luciferina injeção foi realizada para demonstrar a utilidade de uma injeção subcutânea luciferina e identificar o momento ideal para a imagem da administração luciferina seguinte. Três minutos após a luciferina foi injetado o mouse estava sedado, colocada no instrumento Spectrum IVIS e fotografada a cada 3 minutos até uma hora e cada 6 minutos depois que para gerar uma curva de cinética de bioluminescência. Isto demonstrou que a via subcutânea de administração luciferina foi superior a uma injeção intraperitoneal em nossas mãos, e que o tempo ideal para a imagem dos animais foi de aproximadamente 25 minutos após a injeção luciferina quando GL261-luc células foram usadas. Figura 4. Várias visões de um reconst 3-DimensionalGuliForum da implantação intracraniana de GL261-luc2 células co-registradas com o esqueleto do rato e do cérebro. Figura 5. Photon contagens obtidas de tumores resultantes do GL261-luc células vs GL261-luc2 células. Os resultados são uma média de 5 animais. Figura 6. Gráfico de GL261-luc crescimento de células tumorais em um albino C57BL / 6 mouse. Bioluminescência foi medido a cada 3 dias e plotados como in vivo contagem de fótons versus dias pós-implantação. Fotografias mostram bioluminescência em momentos diferentes. Coloração é uma indicação de bioluminescência (intensidade pixel) que é em relação ao número de células tumorais (barra de cor é mostrado à direita). Depois que o animal sucumbiu à doença do cérebro foi dissecada e luciferina foi adicionado topicamente para obter a imag ex vivoe mostrado na figura inserida.