השרשה תוך גולגולתי עם 3D לאחר In vivo Bioluminescent הדמיה של gliomas Murine

1. תא תרבות הקו GL26 תא התקבל אגף טיפול סרטן אבחון (DCTD) המכון הלאומי לסרטן (NCI), פרדריק, מרילנד. כדי להקל על מדידה כמותית של גידול בקצב הצמיחה GL261 התאים נעשו bioluminescent באמצעות HT Lentiphos System (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) עם Lenti X-HT אריזות מיקס (Clontech Laboratories, Inc) ו-FUW GL פלסמיד (מתנה נדיבה מהמעבדה של JB רובין, MD, PhD). תאים נשמרו ב בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) עם 10% טטרציקלין ללא עגל סרום עוברית (FCS; Clontech Laboratories, Inc). GL261 התאים היו גם transfected ביציבות עם luc2 הגן קידוד באמצעות pGL4.51 [luc2 / CMV / ניאו] וקטור (Promega קורפ, מדיסון, WI) ו FuGENE 6 מגיב transfection (רוש ומדע יישומי, אינדיאנפוליס, IN) התנאים הבאים שצוינו על ידי היצרן. הגן luc2 הוא גרסה קודון אופטימיזציה של גחלילית luciferase המספקת פלט אור גבוה באופן משמעותי מאשר הגן לוק סטנדרטי. Transfectants יציבה נבחרו ומתוחזק בתקשורת DMEM FCS המכיל 10% ו 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​Geneticin (G418, Invitrogen קורפ, בקרלסבד, קליפורניה). לפני השתלת התאים בתרבית נקצרים על ידי trypsinzation, שטף פעם DMEM ללא בסרום resuspended ב DMEM ללא סרום בריכוז של 1 x 10 7 תאים / מ"ל. 2. ניתוח הגדרת 2 בסביבה סטרילית נשמרת לאורך כל הניתוח, כולל כל המכשירים, ציוד כירורגי, כפפות, סדינים וכו '. עשרת שבוע C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr הישן (C57BL לבקן / 6) עכברים נרכשים מן המכון הלאומי לסרטן על תוכנית הייצור פרדריק בעלי חיים והשתמשו במשקל ממוצע של 20 גרם (NCI, פרדריק, MD). בעלי חיים מורדמים בזריקה intraperitoneal של xylazine (5 מ"ג / ק"ג), קטמין (50 מ"ג / ק"ג) ו – עצירות (0.05 מ"ג / ק"ג). אלקמצוץ דואר נעשית על מנת להבטיח כי בעל החיים מספקת מרדים לפני הניתוח היא החלה. התנועה (גם אם קלה) של כל חלק של החיה היא אינדיקציה לירידה לרמה של הרדמה. בעלי חיים ניתנת מיד תוספת 3.3 מ"ג / ק"ג xylazine ו 26.6 מ"ג / ק"ג קטמין. טמפרטורת הגוף נשמרת באמצעות מנורה תחבושות סטריליות המכסה את הגוף. לאחר החיה הוא מורדם כראוי, הם ממוקמים על המיטה מרופד של headframe stereotactic (900 דגם קטן Stereotaxic בעלי חיים, דוד Kopf מכשירים) [איור 1]. כמות קטנה (1 / 4 אינץ') של משחה AKWA דמעות חומר סיכה עיניים מוחל על הקרניות. בעלי חיים מובטחת במסגרת stereotactic ידי פתיחת הפה של החיה (על ידי הנחת האצבע המורה והאגודל סביב הלסת של החיה) וגלישה השיניים הקדמיות למעלה לתוך המגרעת בפריים stereotactic. מהדק היא הידקה כדי לאבטח את ראשו של בעל החיים לתוך האוזניות לוודא כי הראש דואר מיושר והעיניים מרוכזים, כדי לוודא זאת לא להפעיל כוח מופרז על ראשו של בעלי חיים. צינור 2 O הוא מודבק ליד הנחיריים של החיה. קצב זרימת החמצן הוא 0.5 ליטר / דקה. הגב התחתון והזנב הוא מודבק אל המיטה stereotactic נזהרים שלא להתפשר נשימה. האתר חתך ניתוחי מגולח. Povidine-יוד מקלות ספוגית משמשים לשטוף את האזור בין העיניים לחזור בשטח שבין האוזניים עם יוד, ולוודא יוד לא לטפטף לתוך העיניים של החיה. התאים מוכנים להשתלה רק לפני הניתוח והם מעורבים באופן תקופתי על מנת להבטיח שהם לא להתפשר. Μl 10, 50 מ"מ העולם Precision Instrument (WPI), בסרסוטה, פלורידה, מזרק עם מחט מד 26 משופעים טעון inoculum התא. אם התאים נראה בכבדות ביחד זה עשוי להיות נחוץ כדי לטעון מחדש את המזרק. מזרק 10 μl ממוקם אז אל UMP3-1 UltramicroPump מיקרו ההזרקה (WPI, בסרסוטה, פלורידה). 3. השרשה תוך גולגולתי 2 החתך בעור נעשית באמצעות 15 גודל להב האזמל מלקחיים שיניים. חתך 10-15 מ"מ עשוי מ longitudinally בין העיניים של החיה, נע לכיוון האוזניים של החיה חשיפת גבחת (בצומת של התפרים sagittal ו העטרה בחלק העליון של הגולגולת). הקפד היטב לזהות את גבחת בשביל זה אפשר להתבלבל בקלות עם שטח הסינוס אשר הדיסטלי של גבחת [איור 2]. אחרי החיה הוא מסומם הוא מקבל זריקה תוך incisional של 0.25% (2.5 מ"ג / מ"ל) bupivacaine. Burrhole עשוי 0.1 מ"מ האחורי כדי גבחת ו 2.3 מ"מ ימינה של קו האמצע על ידי לאט מסובב מד 16 ½ 1 אינטש מחט ביד, הפעלת לחץ מעט המחט תוך סיבוב עד הגולגולת היא חדרה והמוח חשוף. מחט מזרק מועבר לתוך העמדה באמצעות STE Microdriveמזרק בעל reotactic עד שזה נוגע רק פני השטח של המוח. מתוך עמדה זו, המחט היא מתקדמת לתוך המוח לעומק של 3 מ"מ והמשיך במקום במשך 3 דקות. המחט היא נסוגה 0.4 מ"מ לעומק כולל של 2.6 מ"מ מתחת לפני השטח של המוח, ליצור כיס קטן שבו התאים הם להיות חדורים. זה לא חובה, בשלב זה, לקחת תמונה רנטגן של המחט על החיה כדי להבטיח מיקום עומק נכונה. ההשעיה התא הוא החדיר מעל 3 דקות באמצעות מזרק מיקרו מוגדר בהיקף של 2000 NL (2 μL) עם קצב עירוי של 667 NL / דקה. המחט נשארת במקום במשך 2 דקות כדי למנוע דליפה מהאתר של אינפוזיה. המחט היא נסוגה לאט לחלוטין. Burrhole מתמלא שעווה העצם באמצעות מבתר פנפילד. החתך הוא sutured באמצעות 4-0 (1.5 מטרי) vicryl תפר לוודא שאין פערים גדולים נשארים בעור. Vicryl הוא חומר תפר כי להמיסs, ולכן התפרים לא צריך להיות מוסר כאשר החתך נרפא. לאחר הניתוח בעלי החיים ממוקמות בכלוב תחת מנורת חימום המוגדרת בגובה הנדרש כדי לחמם את המשטח התחתון של הכלוב עד 30 ° C. כאשר בעלי החיים נמצאים ער לחלוטין (לשפוט לפי התנועה נורמלי בכלוב) הם חזרו דיור קבוצה. איבופרופן אוראלי מתווסף מי השתייה שלהם במשך 5 ימים לאחר הניתוח. 100 מ"ג איבופרופן לילדים (100mg/5ml) מתווסף בקבוק סטנדרטי 473 מ"ל מים מכרסם. בעלי חיים הם נצפו יומי צילמו ומשקלו כל 3 ימים. שבועיים לאחר ההשתלה תצפית גדל ל פעמיים ליום. בעלי חיים מומתים כאשר הם מראים סימנים של ירידה בריאות הכולל יציבה כפופה, ניידות מופחתת והגוף נראה ירידה במשקל (≥ 20%). תסמינים אלה הם בתגובה פרסם לגידול והם reproducibly יופיעו כ 1 יום לפני מותו, בשל הגידול. 4. Vivo </em> פליטת אור הדמיה 3 הפעל את [חיים תמונה] תוכנה. מערכת הדמיה IVIS מאותחל על ידי לחיצה על [אתחול מערכת IVIS] כפתור בצד הימני התחתון של לוח הבקרה. בחר את [זריח] מצב הדמיה בצד השמאלי העליון של לוח הבקרה. כדי לקבוע את הזמן האופטימלי של הדמיה לאחר ההזרקה luciferin מחקר הקינטית הכרחית [איור 3]. תיאור זה של גחלילית בלוציפראז; הזרק 10μl / g משקל הגוף של D-luciferin גחלילית (15mg/ml ב-PBS, Caliper מדעי החיים קטלוג XR-1001 או מוצר דומה מיצרן אחר) אל בעלי החיים, כמתואר להלן. חכה 3 דקות, ואז להרדים את העכבר על ידי הצבתו בתוך תא הגזים הרדמה (2% גז Isoflurane ב O 2). כבה את גז הרדמה לחדר ופתח את שסתום הרדמה ואת ואקום סעפת IVIS. מיד למקום בעלי חיים מסומםעל פלטפורמת הדמיה מבוקר טמפרטורה, מוודא נחיר של העכבר ממוקם כראוי סעפת גז ההרדמה. התמונה הראשונה צריך לקחת כ 5 דקות לאחר ההזרקה luciferin. עד 5 חיות ניתן הדמיה בבת אחת במכשיר ספקטרום IVIS. אם פחות מ -5 בעלי חיים יש הדמיה, ניתן לחבר את סעפת בשימוש (ים) כדי לחסוך על דלק isoflurane. המשך לקחת תמונות כל 3 דקות על ידי יצירת רצף של עד שעה כדי ליצור עקומת הקינטית לביטוי luciferin. לחץ על [הגדרת רצף] כפתור בלוח הבקרה. עורך רצף מופיע. בלוח הבקרה, ציין את ההגדרות עבור התמונה bioluminescent הראשון ברצף. מומלץ להתחיל עם binning בינוני. אנו ממליצים גם חשיפה אוטומטית על מנת לקבוע את זמן החשיפה האופטימלית. בחר את [עיכוב] כפתור בעורך ברצףnd לציין זמן עיכוב של 3 דקות בין כל רכישה. לחצו [הוסף] עורך את הרצף. הפרמטרים רכישת מתווספים אז אל השולחן. חזור על שלב 4 עבור כל תמונה ברצף. לאחר העקומה נוצר, בזמן הדמיה אופטימלית יכול להיקבע על ידי זוממים את עוצמת האות (אינטנסיביות) לעומת הזמן. בעלי חיים תמונה בזמן הגבוה in vivo פוטון לספור כדי לקבל את האות החזק ביותר והמדויק ביותר. ניסויים מוקדמים בשימוש הזרקת intraperitoneal (IP) של luciferin, לעומת זאת, זריקות ip מדי פעם הביא תוצאות לסירוגין מראה מעט פליטת אור אין בגידול. החוקרים שיערו כי חוסר אקראי פה ושם אות נבע משלוח של luciferin אל המעי או לאיברים פנימיים אחרים. לכן החלו להשתמש תת עורית (SC) luciferin זריקות וראינו שחזור הדמיה גדול [איור 3]. עשריםדקות לאחר ההזרקה sc, בעלי החיים מורדמים ידי הצבתם בתא עם גז Isoflurane 2% O 2 עד שהם מגיבים. החיה הרדים (ים) מועברים לחדר ההדמיה. משחת עיניים אמור לשמש למחקר הקינטית בגלל האורך של הדמיה. זה לא נדרש לצורך הליכי הדמיה אחרים, כי הם קצרים משך. התמונה נרכשה על binning בינוני עם זמן חשיפה 5 דקות. אפשרות רכישת רכב עשוי לשמש גם. אם אות רווי ו / או להתעלף בכל binning בינוני, זמן binning או חשיפה יכול להיות מותאם. קבצים התוכנית והערות תמונה הבאים נשמרים בספרייה במחשב של המשתמש. 5. 3D Imaging 3 לחץ על הכרטיסייה [הדמיה אשף] ב [הגדרת רצף] את החלון של לוח הבקרה. בחר את [פליטת אור] במצב הדמיה במסך אשף להתחיל הדמיה CLאיכס [הבא]. ב "פליטת אור – DLIT" חלון אשף הדמיה, בחר [Firefly] בדיקה הכתב. הפליטה / עירור של הספקטרום גחלילית נבחר מקור יופיע עם שש בחירות לסנן המתאים להירכש. המסך האחרון יופיע עם ברירות מחדל הכוללות חשיפה אוטומטית רכישת פרמטרים של שדה של הגדרות ברירת מחדל צפה C. לעבוד טוב מאוד, עם זאת, הגדרות אלו ניתן לשנות במידת הצורך. לחץ על [הבא] וחלון עורך רצף יהיו מאוכלסים עם רצף של שישה אזורים ספקטרלית ב 20 ננומטר מסננים רחב (560 ננומטר, 580 ננומטר, 600nm, 620 ננומטר, 640 ננומטר, ו 660nm). לחצו על [רוכשת את רצף]. המסנן הראשון (560 ננומטר) יכלול דפוס אור מובנה באמצעות לייזר גלונומטר להקים הטופוגרפיה משטח. בחר את [פני טופוגרפיה] הכרטיסייה צבעים הכלי. החלקת פני השטח יכול להיות מיושם על התחשבות בכל זוויות חדות שנוצרו במהלך תהליך השיקום.החלקה מחדל נמוך מומלץ. לחץ על [יצירת] ואת תיבת לניתוח טומוגרפיה יופיע. צייר תיבת היבול הכולל את החיה כולה ולאחר מכן לחץ על [הבא]. כלי סף יופיעו כמסיכה סגול על האזור הנבחר. המסכה צריכה להיות מוגדר באופן אוטומטי כדי להתאים את התמונה של החיה. במידת הצורך, להתאים את הסף של המסכה יותר כראוי להתאים את קווי המתאר של החיה. לחץ [סיום] ואת רשת משוחזר יופיע. שחזור לאחר מכן ניתן לשמור הכרטיסייה התוצאות. בעקבות הקמתה של הטופוגרפיה משטח של בעל החיים, המשך [DLIT 3D Reconstruction] נפתחת על הפלטה בכלי. בכרטיסייה [ניתוח] לבחור כל ששת אורכי גל כדי לבצע את השחזור. בטל תמונות הניב פיקסלים רווי או ספירת מתחת 600. עזוב הגדרות הכרטיסייה [פרמטרים] כברירת מחדל. בכרטיסייה [מאפיינים], "שרירים" אמור להיות רשום כבחירה ברירת המחדל עבורמאפיינים r רקמות, ו "Firefly" צריך להיות רשום ספקטרום המקור. לחץ [לשחזר] תחת הלשונית ניתוח, ואת שחזור 3D של פני השטח של בעלי חיים שיקום המקביל מקור האות להופיע [איור 4]. כדי לקבוע את המיקום ואת עוצמת האות, בחר בלחצן Voxels בכרטיסייה כלים 3D של צבעים הכלי. צייר ריבוע סביב כל voxels יוצג מדידות השטף הכולל מוצג בתחתית הכרטיסייה את עוצמת הקול. לחץ על [מרכז מסה] כדי לזהות את מיקום האות של voxels שנבחר. העטרה, פרוסות sagittal ו transaxial של החיה יופיע ושימוש [הסמן תצוגה מדידה] המרחק בין פני השטח של החיה למרכז voxel ניתן למדוד. עיין במדריך תמונה חיה של תוכנה למשתמש לקבלת מידע נוסף על רישום משותף של אטלסים איברים ותכונות מתקדמות אחרות. 6. נתוניםnalysis 3 לאחר התמונה היא רכשה והציל, לגשת לקובץ התוכנית על ידי לחיצה על הלחצן [עיון] ובחירת הקובץ. מידע התמונה ניתן למצוא תחת [הצג] → [מידע תמונה]. עוצמת האות ניתן לכמת ידי בחירת אזור (ROI) כפתור ריבית [ROI כלים]. ודא את התמונה הוא ניתח תחת מצב [פוטון] על ידי בחירת "פוטון" ברשימה הנפתחת בפינה השמאלית העליונה של לוח הבקרה התמונה. בחר את [מדידת ההחזר על ההשקעה] כפתור מן הנפתחת "סוג" הרשימה. בחר את הצורה ROI של ריבית; האפשרויות כוללות עיגול, ריבוע, ו או רשת. כיסוי בכל תחומי בעוצמה על התמונה הנרכשת. עמדת ההחזר על ההשקעה נקבעת על ידי גרירת הבחירה בצורת החזר ההשקעה לאזור שמכיל את האות bioluminescent. עוצמת האות של ההחזר על ההשקעה מחושב על ידי לחיצה על [מדוד] כפתור. התווית ROI מציג את העוצמה. ההחזר על ההשקעה של יכול להיות מנוהל ונשמר USIng התוכנה תמונה חיים. 7. נציג תוצאות: השתלת תא מוצלח ניכר כאשר התאים המושתלים אינם לזיהוי באמצעות ספקטרום IVIS ביום הניתוח. שני GL261 לוק ו-GL261 luc2 תאים לזיהוי, לעומת זאת, הגן luc2 יספק רמה גבוהה יותר של פליטת אור [איור 5]. תמונות שצולמו זמן קצר לאחר ההשתלה אולי לא ספציפית איתות על הכפות של החיה ואת האף אשר צריך להתעלם כרקע. אותות הממוקם באתר ההשתלה אמיתי האות יגדל עם הזמן [איור 6]. ירידת עוצמת האות ביום 6 ניתנת לשחזור וככל הנראה בשל אובדן של הגידול לקחת על ידי כמה מן התאים המושתלים. מדידות כמותיות של נטל הגידול ולייצר בכך שהם צריכים לעלות בהתמדה עד שהחיה בסופו של דבר נכנע למחלה. עם זאת, עקומות גדילה יהיה תלוי במידה רבה במצב של התאים המושתלים, או var ו קטין נמנע iability בהליך ההשתלה. במעבדה שלנו בחרה חיות תמונה מושתל כל שלושה ימים. באיור 1. אחרי העכבר הוא מורדם כראוי, היא ממוקמת בפריים stereotactic. ראש העכבר מאובטח באמצעות מהדק את הפה. באיור 2. לאחר העור הוא פתח את ציוני הדרך העיקריים הם זיהו אנטומי כולל לכלול את גבחת, את התפרים העטרה ועל sagittal. Burrhole עשוי 2.3mm בצד ימין של גבחת ידי לאט מסובב מד 16 ½ 1 מחט אינץ' עם כמות קטנה של לחץ עד הגולגולת היא חדרה והמוח חשוף. באיור 3. השוואה הקינטית של תת עורית (iles/ftp_upload/3403/3403fig3_1.jpg "alt =" Figure3.1 "/>) לעומת intraperitoneal ( ) הזרקה luciferin בוצע כדי להדגים את התועלת של זריקה תת עורית luciferin כדי לזהות את הזמן האופטימלי הממשל הבא תמונה luciferin. שלוש דקות לאחר luciferin היה להזריק את העכבר היה מסומם, להציב מכשיר ספקטרום IVIS וצילמו כל 3 דקות עד שעה כל 6 דקות לאחר מכן כדי ליצור עקומה קינטית של פליטת אור. זה הוכיח כי תוואי תת עורית של luciferin הממשל היתה עדיפה על זריקה intraperitoneal בידיים שלנו, כי הזמן האופטימלי לתמונה חיות כ -25 דקות לאחר הזרקה luciferin כאשר GL261 לוק התאים היו בשימוש. איור 4. תצוגות מרובות של reconst 3 מימדיבבינוי של ההשתלה תוך גולגולתי של GL261-luc2 תאים שיתוף רשום עם שלד העכבר המוח. איור 5. ספירות פוטון המתקבל גידולים הנובעים GL261 לוק תאים vs-GL261 luc2 תאים. התוצאות הן ממוצע של 5 חיות. איור 6. גרף הצמיחה GL261 לוק תא הגידול C57BL לבקן / 6 העכבר. פליטת אור נמדדה כל 3 ימים ו זממו כמו לספור פוטון vivo לעומת ימים לאחר ההשתלה. תמונות להראות פליטת אור בנקודות זמן שונות. סוג צבע הוא אינדיקציה של פליטת אור (עוצמת פיקסל) אשר ביחס למספר תאים סרטניים (פס צבע מוצג מימין). אחרי החיה נכנעה למחלה במוח היה גזור ו luciferin נוספה מקומי כדי להשיג את מתאר לעצמי לשעבר vivoדואר שמוצג באיור הבלעה.