이미징을위한 간단한 방법 Arabidopsis는 Infiltrative 영상 매체로 Perfluorodecalin를 사용하여 잎
Summary
우리는 infiltrative 설치 매체로 perfluorodecalin의 사용을 설명합니다. 이것이 영상의 깊이를 개선하기위한 간단한 방법입니다<em> Arabidopsis thaliana</em최소한의 생리적 영향> 잎 조직.
Abstract
생물 학적 샘플로 깊이 고해상도 이미지를 획득의 문제는 크게 1 인정받고 있습니다. 이러한 추가적인 문제가 세포와 airspaces 사이의 생물 학적 조직과 광학 시스템의 나머지 부분 사이의 세포 구성 요소 사이의 굴절률에 여러 전환에서 발생하는 식물 잎이나 척추 폐의 해면 mesophyll으로 공기 주입 조직에. 또한, 굴절률의 불일치는 형광단 여기 및 형광 현미경에서 신호 방출의 감쇄로 이어집니다. 우리는 광학 레이저의 파워에 손상을 증가 resorting 않고, 깊이에서 공촛점 현미경 (LSCM) 샘플 이미지를 스캐닝 레이저를 개선하고 최소의 생리적 영향이있다 infiltrative 영상 매체로 여기 perfluorocarbon의 응용 프로그램 perfluorodecalin (PFD)를 설명합니다. 우리는 그것의 결과로 광학 Arabidopsis thaliana 복잡 잎 조직과 함께 PFD의 사용을 위해 프로토콜을 설명구조 (그림 1). PFD이 사용 세에 적합하게 속성을 가지고 있습니다. PFD의 굴절률 (1.313)은 물 (1.333)의와 비교하고 공기 (1.000)보다 cytosol (약 1.4)의에 가까운 것입니다. 또한, PFD가 아닌 형광등, 즉시 가능하며 무독성이다. 그것이 홍수하실 수 있습니다 stomatal 침투 4,에 대한 – PFD의 낮은 표면 장력 (19 dynes cm -1)는 물 (72 dynes cm -1)의보다 낮은 것이며, 또한 한도 (30 다인의 cm -1 25) 다음과 같습니다 잠재적으로 파괴적인 진공이나 계면 활성제의 응용 프로그램없이 해면 mesophyll의 airspaces. 마지막으로 결정적인 PFD는 CO 2와 가스 교환이 때문에 시료에 생리적인 영향을 최소화, 홍수 조직에 유지 수 있습니다 O 2, 분해에 대한 큰 용량을했습니다. 이 속성은 부분 액체 호흡과 폐 infla를 포함 다양한 어플 리케이션에 사용되고있다기 5,6, 수술 7, 인공 혈액 8, 성장의 산소 미디어 9, 식물 10 얼음 결정 형성 연구. 현재는 라이브 공촛점 이미징을위한 물 또는 수성 버퍼에 조직을 마운트하는 것이 일반적이다. 우리는 마운트 매체로 PFD의 사용은 기존의 관행에 대한 개선을 나타내는 및 이미징에 대한 라이브 잎 전체 샘플의 간단한 준비를 허용 생각합니다.
Protocol
Discussion
이것은 공기 주입 또는 광학 복잡한 조직의 현미경을 향상시킬 수있는 간단하고 사용하기 쉬운 기술입니다. 우리는 기술이 몇 가지 강력한 장점을 가지고 있으며, 우리는 그것이 공기 풍부한 조직에 관한 생물 학적 질문을 명료하게하다하는 데 사용될 수 있기를 바랍니다 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 그것은 식물 mesophyll이나 폐에 병원체 공격의 연구에 대한 자연 선택이 될 것입니다. 우리는 또한 기술의 한계를 알고 있습니다. 우리는 더 굴절률 정합 작업 있으며, 긴 timescale 실험시 현미경의 다른 모드 및 perfluorocarbon mountant 보충과 함께 사용합니다. 우리는 또한 PFCs의 주요 장점 중 하나는, 즉 생물학적으로 불활성 flipside가되고, 그렇게, 인식하고 있습니다. PFCs는 쉽게 또한 쉽게 이러한 호르몬, 약물, 그리고 다른 작은 분자 또는 이온과 같은 관심의 화합물을 전달하는 데 사용할 수 없다는 것을 의미 생물 학적 분자를 분해하지 않습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그의 조언과 Exeter에의 Bioimaging 시설의 대학은 Exeter의 대학의 교수 니콜라스 노프 감사하고 싶습니다. 기금은 영국의 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회 (부여 BB/E002682/1 참조)에 의해 제공되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
- Inoue, S., Pawley, J. P. Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd. , 1-16 (2006).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C. S. m. i. r. n. o. f. f., N, ., Love, J. Perfluorodecalin substantially improves confocal depth resolution in air-filled tissues. New. Phytologist. 186, 1018-1025 (2010).
- Sargent, J. W., Seffl, R. J. Properties of perfluorinated liquids. Fed. Fed. Proc. 29, 1699-1703 (1970).
- Schönherr, J., Bukovac, M. J. Penetration of stomata by liquids. Plant Physiol. 49, 813-819 (1972).
- Davies, M. W. Liquid ventilation. Paediatr. Child. Health. 35, 434-437 (1999).
- Shaffer, T. H., Wolfson, M. R., Greenspan, J. S., Hoffman, R. E., Davis, S. L., Clark, L. C. Liquid ventilation in premature lambs: uptake, biodistribution and elimination of perfluorodecalin liquid. Reprod. Fertil. Dev. 8, 409-416 (1996).
- Crafoord, S., Larsson, J., Hansson, L. J., Carlsson, J. O., Stenkula, S. The use of perfluorocarbon liquids in vitreoretinal surgery. Acta. Ophthalmol. Scand. 73, 442-445 (1995).
- Lowe, K. C. Engineering blood: synthetic substitutes from fluorinated compounds. Tissue Eng. 9, 389-399 (2003).
- Wardrop, J., Edwards, C. M., Lowe, K. C., Davey, M. R., Power, J. B. Cellular responses of plant protoplasts to culture with oxygenated perfluorocarbon. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 501-505 (1997).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of fluorocarbons to study freezing in plant tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).
